细胞中3D肿瘤多球检测方案(高内涵成像)

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药物发现的未来：3D活细胞分析 SARTORIUS药物发现的未来：3D活细胞分析 多球、共培养、3D肿瘤试验的实时活细胞分析 Kalpana Patel 1， Miniver Oliver 1， Nevine Holtz 2，Tim Jackson2 Nicholas Dana 2. Tim Dale1. Del Trezise 1 1Sartorius， Hertfordshire， United Kingdom；2 Sartorius， Ann Arbor， United States 越来越多的证据表明，与2D单层细胞模型相比，涉及微组织和类器官的研究能提供更多的预测性和转化观察结果12。此外，多细胞肿瘤球在肿瘤学和肿瘤免疫学研究中的应用也在增加。体外模型试图重现肿瘤微环境可能包含细胞外基质(ECM)和其他的细胞类型，如基质细胞、内皮细胞和免疫细胞，使研究人员能够评估药物的功能、评价化疗耐药性及免疫-肿瘤细胞间的相互作用。 目前用于评估肿瘤球体生长和缩减的方法通常受到耗时、昂贵和/或费力的分析工作流程的限制。 这可能包括荧光探针的生物学干扰，终点法分析可能错过有见地的时间点信息，或间接生化读数忽略有价值的形态学洞察力。 Incucyte@活细胞分析系统是一个全自动高清相差和双色荧光图像采集及分析平台，在一个标准的细胞培养箱中工作，以获得最佳的细胞活力并维持生理相关性。该仪器设计用于在预先设定的时间间隔内反复扫描组织培养板和培养瓶，使用户能够连续监测培养细胞并生成可量化的动态信息。Incucyte@肿瘤球软件模块作为一个快速、灵活和强大的控制中心，用于不间断的活细胞分析，包括图像采集、处理及数据可视化。 Vitanovski/Getty图像 试剂包括无干扰、细胞标记、核靶向GFP(绿色荧光蛋白)和RFP(红色荧光蛋白)等，用于细胞定量。 检测原理 本应用说明描述了使用Incucyte@活细胞分析系统和Incucyte@3D多肿瘤球分析来研究3D肿瘤多球的生长，可与成纤维细胞或免疫细胞共培养，捕捉采用单时间点方法可能错失的数据。增强型景深明场(DF-明场)图像采集能够对生长在细胞外基质(MatrigelTM)上的多肿瘤球进行长时间成像。 这一优越的图像采集可获得具有高对比度的明场图像，使用内置的Incucyte@处理软件可以轻松识别(mask)。明场目标的大小、计数和偏心度会随时间自动绘制，提供关于肿瘤球形成和生长速率的丰富的信息。可采集、分析及绘制数千张图像，可以同时运行多达六块96孔板以提高通量。 本文我们展示了验证方法和数据以阐述Incucyte@活细胞分析系统的能力，包括动态可视化和量化基质细胞对肿瘤多球形态及对化疗药物敏感性的影响，并评估免疫细胞介导的对肿瘤多球的杀伤毒性。 TC+基质细胞 CC TC+免疫细胞 CC 1.包被培养板 2a.加入细胞 2b.加入细胞 3.加入免疫细胞 4.加入处理药 (第0天) (第0天) (第3天) 包被培养板(50%Matrigel， 40pL/孔)。在37℃下聚合30分钟。 孔，各75pL)。 测多球形成，3天。 将免疫细胞加入培养的肿瘤细胞中(50pL/孔)。 在共培养体系加入适当的处理药(50pL/孔)，以4倍最终分析浓度。监测多球的增殖和死亡情况。 1.96孔微量滴定板包被一层MatrigelTM(Corning)(40pL/孔，用无血清培养基稀至最低浓度4.5mg/mL)，在37℃聚合30分钟 2.收集相关的细胞，计数并按所需的密度接种于预包被的96孔板中(150或100pL/孔) a.肿瘤细胞和基质细胞共培养：肿瘤细胞和基质细胞以1：1的比例接种(150uL/孔，每种细胞各75uL)b.肿瘤细胞和免疫细胞共培养：仅接种肿瘤细胞(100uL/孔) 3.使用Incucyte@图像分析系统监测多球的形成，持续3天(DF@明场采集，10倍放大，每6小时一次) 4.多球形成后，以优化的效靶比(E：T)将相关的免疫细胞加入单培养的肿瘤细胞中，体积为50pL/孔 5.在共培养分析板加入适当的处理药(50pL/孔)，以4倍的最终分析浓度，终体积为200uL/孔 6.Inucyte@ S3(6小时重复扫描)监测多球的增殖情况，持续长达10天。 图2：使用Inucyte@DF-BF图像进行形态观察，并使用实时分析对多球大小和动态生长进行量化。SK-BR-3细胞接种于Matrigel包被的96-孔平底板上，单培养或与NHDF共培养(1：1比例，各1000个细胞/孔)，多球(MS)形成(3天)。SK-BR-3单培养或与NHDF共培养的多球，Inucyte@扩展景深明场(DF-明场)成像(细胞接种后8天)。明场mask轮廓以黄色显示。注意，NHDFs对SK-BR-3多球形态和大小(总面积)的影响。统计图显示了每孔的明场总面积(Total Brightfield Object Area， um²)(y轴)随时间(h)(x轴)的变化，并说明了不同乳腺肿瘤细胞与NHDFs共培养的多球表现出细胞类型特异性动力学生长曲线。每隔6小时收集数据，总计192小时。每个数据点代表平均值±SEM，n=15孔。 总BF面积x105 总BF面积x105 (um2/image) 收集细胞，并接种到包被有40pL/孔Matrigel基底的96孔板(Corning No. 3595)。细胞接种3天后，可形成所需大小的多球。Incucyte@S3监测球体形成，每隔6小时一次，总计3天。使用Lymphoprep密度梯度试剂(StemCellTechnologies)从健康供体的白膜层中分离出外周血单核细胞(PBMC)，用添加10%FBS的RPMI1640培养。 基质细胞对多球形态的影响 NHDFs显示出对肿瘤多球的形态有显著影响。SK-BR-3细胞单独或与NHDFs(1：1比例，各1000细胞/孔)接种，每6小时采集DF明场图像。在单独培养中，SK-BR-3细胞未能形成紧密的多球；而与NHDFs共培养中则形成了更紧密的聚集体(图2)。 图3：Inucyte@DF明场成像显示了形态的时间变化。MDA-MB-231细胞接种于包被Matrigel的96-孔平底板上，单培养或与NHDFs共培养(1：1比例，各1000细胞/孔)，多球形成(3天)。Incucyte@S3DF明场图像对比单培养和共培养的情况，7天(细胞接种后10天)。注意NHDFs对球体形态的时间效应。 96孔多球生长和缩减检测用于药理学分析 为了证明这种3D肿瘤细胞与基质细胞共培养对化合物毒性试验的反应，使用一组四种常用的乳腺肿瘤细胞系进行了药理学研究；MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3和BT-474。 细胞与NHDFs共培养(1：1比例，各1000细胞/孔)，多球形成3天，用细胞毒性药物(拉帕替尼、ZK164015和喜树碱(CMP))处理(长达10天)。 Incucyte@的实时、自动化孔板预览能够快速可视化处理对多球大小(总BF面积)的影响。96孔板预览MCF7多球mask分析，说明了ZK164015和CMP对球体大小的浓度依赖性抑制(图4)。 可视化明场图像验证了拉帕替尼对SK-BR-3大小的特异性细胞毒作用，以及CMP对MCF7和SK-BR-3球体的非特异性细胞毒作用(图5)。 使用曲线下面积(AUC)的时间进程数据分析建立了浓度响应曲线(图6)。 处理组 MCF7-NR+NHDF 图4：Incucyte@S3孔板视图可以快速可视化和定量处理效果。MCF7细胞与NHDFs共培养，接种于预包被(Matrigel)的平底96孔板(1：1比例，各1000细胞/孔)，形成多球(3天)。然后用已知的标准护理和梯度稀释的细胞毒性化合物处理球体(5天)。Incucyte@微孔板视图显示了处理对多球大小的影响。顶部图像显示处理后5天明场目标面积(Brightfield Object Area，um?)识别mask(黄色)。底部图像显示每孔总明场目标面积(TotalBrightfield Object Area，um?)(y轴)随时间的变化(处理后0-5天)(x轴)。 对照组 Lapitinib (10 pM) 工Z乏 图5：查看图像以获得更多洞察力。MCF7或SK-BR-3细胞与NHDFs共培养，接种于预包被(Matrigel)的平底96孔板(1：1比例，各1000细胞/孔)中，形成多球体(3天)，然后用拉帕替尼和喜树碱(CMP)处理。Incucyte@明场图像(5天)显示处理对多球体大小和完整性的影响。注：CMP对MCF7和SK-BR-3多球的细胞毒性作用及多球对拉帕替尼敏感性的差异。 拉帕替尼和ZK164015对多球生长的抑制与这些药物靶向受体的已知的表达曲线一致3。EGRF和HER2酪氨酸激酶双重抑制剂拉帕替尼对SK-BR-3和BT-474多球的生长具有浓度依赖性抑制作用，而雌激素受体(ER)拮抗剂ZK164015则是MCF7多球生长的有效抑制剂。ZK164015对无ER表达的多球几乎没有作用。DNA拓扑异构酶抑制剂CMP对所有多球体的生长具有同等的抑制作用。 Herceptin@介导对HER2阳性多球的ADCC 单克隆抗体对免疫介导杀伤的调节是免疫治疗的一个重要作用机制4。诸如赫赛汀(靶向HER2受体的人源化单克隆抗体)等抗体与受体的结合会诱导抗体依赖性、细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。 用HER2阳性(SKOV3和BT474)和HER2阴性(MCF7)多球，评价赫赛汀诱导的ADCC作用。 MCF7 %对照组 (BFarea AUC) SK-BR-3 %对照组 (BF area AUC) 120 log [compound](M) MDA-MB-231%对照组 (BF area AUC) log [compound](M) BT-474 %对照组 (BF area AUC) 120 图6：通过生成浓度响应曲线进行可靠且可重复的药理学分析。一组4种乳腺肿瘤细胞系与NHDFs接种于96孔平底板Matrigel上(1：1比例，各1000细胞/孔)。形成多球体3天，然后用标准护理和细胞毒性药物处理。浓度响应曲线(CRCs)显示了处理后0-6天(MCF7，MDA-MB-231)或0-10天(SK-BR-3，BT-474)的总明场面积(um²)时间进程数据(未显示)的曲线下面积(AUC)。每个数据点代表平均值±SEM，n=9-12孔。注：不同细胞类型的化合物药理学差异。 图7：赫赛汀诱导的PBMC对多球增殖的影响。将稳定表达核RFP(SKOV3-NR、MCF7-NR)或胞质GFP(BT-474-CyG)的肿瘤细胞接种于平底96孔板的Matrigel上(1000细胞/孔)，形成多球体(3天)，然后加入新分离的PBMC(E：T， 5：1)和赫赛汀。Incucyte@S3明场和荧光图像(7天， SKOV3-NR、MCF-NR；或10天， BT-474-CyG)，对比未加入PBMC(上图)和加入PBMC(下图)的情况下，赫赛汀对肿瘤球增殖的影响(明场mask显示为黄色)。注意在PBMC存在时HER2阳性(SKOV3和BT474)多球体荧光强度的损失。 稳定表达核RFP(NR)或胞质GFP(CyG)的肿瘤多球，与新鲜分离的外周血单核细胞(PBMCs)(E：T， 5：1)共培养，并用赫赛汀处理。使用明场边界内的荧光强度(无需mask荧光肿瘤多球)，对多球的增殖和免疫细胞介导的细胞毒性进行动态定量。 赫赛汀对HER2阳性多球体具有浓度依赖性的细胞毒性作用，而对HER2阴性多球体则无此作用。BT-474多球体表现出对赫赛汀的细胞毒性更敏感，赫赛汀在最高试验浓度(1ug/mL)下对其产生约80%的抑制作用，而对SKOV3多球体则产生约50%的抑制作用(图8，浓度响应曲线)。用抗CD3抗体和IL-2(各10ng/mL)激活的PBMCsT细胞群对所有细胞类型都具有最大的杀伤力(图8，时间进程)。 --3.2e-4pgml →-1.6e-3 ugml --0.01e pg mH --0.04ugml -0.2pgml --1pgml MS Alone MS+PBMCs · MS+IgG(1 mg/mL) · MS+AntiCD3/IL2 (10 ng/mL) 图8：HER-2阳性多球的ADCC免疫细胞杀伤的动态量化。肿瘤细胞接种于96孔平底板的Matrigel上(1000细胞/孔)，形成多球(MS)3天。一旦形成，MS与新鲜分离的PBMCs(E：T，5：1)共培养，并用连续稀释的赫赛汀处理。时间进程显示多球体的死亡，通过球体明场目标内荧光强度的损失进行量化。赫赛汀的浓度响应曲线显示HER2阳性多球体(SKOV3和BT-474)之间的敏感性差异。激活的T细胞群(抗CD3和IL-2，10ng/mL)处理，导致了所有细胞类型的最大MS细胞毒性。每隔6小时收集数据，总计10天。每个数据点代表平均值+SEM，n=4孔。 在本应用说明中，我们证明了Incucyte@活细胞分析系统结合Incucyte@球体软件模块，能够实现3D多球体与基质细胞或免疫细胞共培养随时间推移的实时分析，并适用于化合物试验。我们已经证明： ·活细胞分析表明， SK-BR-3与NHDFs共培养时可形成更紧密的多球体 ·活细胞成像显示NHDFs对MDA-MB-231多球形态的时寸间效应 ·阐明一组乳腺肿瘤多球体的细胞类型特异性时间生长曲线 ·在96孔板完成实时化合物分析的能力 ·实时动态可视化和定量抗体依赖性细胞介导的对靶肿瘤多球的细胞毒性(ADCC)的能力 ▪赫赛汀激活的PBMC导致HER2阳性多球体活力的浓度依赖性丧失 更先进的3D模型，包含细胞外基质和其他的细胞类型(例如基质细胞或免疫细胞)，有可能为肿瘤生物学中肿瘤微环境的研究提供更多相关的转化模型。 Incucyte@活细胞分析系统的几个特点对实时监测和客观量化3D多球生物学具有特别的优势。DF-明场成像可以以96孔分析形式对3D球体的形态和增殖进行无标记研究，以提高通量。无需选择预设的终点，明场图像的一致性分割和量化可以实现细胞依赖性生长曲线的动力学评估，以及基质细胞对肿瘤多球的化疗药物耐药性的影响。明场成像与荧光成像相结合，实现可视化和量化肿瘤多球的免疫细胞介导毒性。 Incucyte@的自动图像采集与用户友好的分析工具和实验室测试方案相结合，使得非专业用户得以快速生成可重复的数据、进行分析并生成可发表的图表。综上所述，Incucyte@活细胞分析系统、球体软件模块和试剂提供了一个独特而高效的技术平台，可以整合到现有的工作流程中。 ( 参考文献 ) 1.Lv D，et al. Three-dimensional Cell Culture： A PowerfulTool in Tumor Research and Drug Discovery (Review).Spandidos Publications. Oncology Letters，14；6999-7010(2017) 2.Verjans ET， et al. Three-dimensional cell culturemodels for anticancer drug screening： Worth theeffort? Cell Physiol.Apr；233(4)；2993-3003(2018) 3.Subick K，et al. The Expression Patterns of ER， PR，HER2，CK5/6，EGFR，Ki-67 and AR byImmunohistochemical Analysis in Breast Cancer CellLines. Breast Cancer： Basic and Clinical Research，4；35-41(2010) 4.Griggs J，et al. The State of the Art：Immune-mediated Mechanisms of MonoclonalAntibodies in Cancer Therapy. British Journal ofCancer， 104；1807-1812(2009) Incucyte@相关文献肿瘤球生长动力学和细胞数量 Cazet AS， et al. Targeting stromal rremodelingand cancer stem cell plasticity to overcomechemoresistance in triple negative breastcancer. Nat Commun.， Jul 24；9(1)：2897 (2018) 肿瘤微环境 Salo T， et al. Organotypic three-dimensionalassays based on human leiomyoma-derivedmatrices. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.，Jan5；373(1737)(2018) 基质与3D培养 Bohovic R， et al. 3D multicellular models reflectthe efficiency of MSC-directed enzyme/prod-rug treatment. Neoplasma， 62(4)；521-30 (2015) |GENengnews.com 多球、共培养、3D肿瘤试验的实时活细胞分析越来越多的证据表明，与2D单层细胞模型相比，涉及微组织和类器官的研究能提供更多的预测性和转化观察结果。多细胞肿瘤球在肿瘤学和肿瘤免疫学研究中的应用也在增加。目前用于评估肿瘤球体生长和缩减的方法通常受到耗时、昂贵和、或费力的分析工作流程的限制。这可能包括荧光探针的生物学干扰，终点法分析可能错过有见地的时间点信息，或间接生化读数忽略有价值的形态学洞察力。Vitanovski/Getty图像Overview应用说明《多球、共培养、3D肿瘤试验的实时活细胞分析》描述了使用Incucyte® 活细胞分析系统和Incucyte® 3D多肿瘤球分析来研究3D肿瘤多球的生长，可与成纤维细胞或免疫细胞共培养，捕捉采用单时间点方法可能错失的数据。增强型景深明场（DF-明场）图像采集能够对生长在细胞外基质（Matrigel™）上的多肿瘤球进行长时间成像。Incucyte® 活细胞分析系统这一优越的图像采集可获得具有高对比度的明场图像，明场目标的大小、计数和偏心度会随时间自动绘制，提供关于肿瘤球形成和生长速率的丰富的信息。可采集、分析及绘制数千张图像，可以同时运行多达六块96孔板，以提高通量。   检测工作流程   本文展示了验证方法和数据，以阐述Incucyte® 活细胞分析系统的能力，包括动态可视化和量化基质细胞对肿瘤多球形态及对化疗药物敏感性的影响，并评估免疫细胞介导的对肿瘤多球的杀伤毒性。- 活细胞分析表明，SK-BR-3与NHDFs共培养时可形成更紧密的多球体- 活细胞成像显示NHDFs对MDA-MB-231多球形态的时间效应- 阐明一组乳腺肿瘤多球体的细胞类型特异性时间生长曲线- 在96孔板完成实时化合物分析的能力- 实时动态可视化和定量抗体依赖性细胞介导的对靶肿瘤多球的细胞毒性（ADCC）的能力- 赫赛汀激活的PBMC导致HER2阳性多球体活力的浓度依赖性丧失Download eBOOK下载《多球、共培养、3D肿瘤试验的实时活细胞分析》全文下载全文数据结果抢先看Incucyte® S3孔板视图可以快速可视化和定量处理效果。MCF7细胞与NHDFs共培养，接种于预包被（Matrigel）的平底96孔板（1:1比例，各1000细胞/孔），形成多球（3天）。然后用已知的标准护理和梯度稀释的细胞毒性化合物处理球体（5天）。Incucyte® 微孔板视图显示了处理对多球大小的影响。顶部图像显示处理后5天明场目标面积（Brightfield Object Area，μm2）识别mask（黄色）。底部图像显示每孔总明场目标面积（Total Brightfield Object Area，μm2）（y轴）随时间的变化（处理后0–5天）（x轴）。赫赛汀诱导的PBMC对多球增殖的影响。将稳定表达核RFP（SKOV3-NR、MCF7-NR）或胞质GFP（BT-474-CyG）的肿瘤细胞接种于平底96孔板的Matrigel上（1000细胞/孔），形成多球体（3天），然后加入新分离的PBMC（E:T，5:1）和赫赛汀。Incucyte® S3明场和荧光图像（7天，SKOV3-NR、MCF-NR；或10天，BT-474-CyG），对比未加入PBMC（上图）和加入PBMC（下图）的情况下，赫赛汀对肿瘤球增殖的影响（明场mask显示为黄色）。注意在PBMC存在时HER2阳性（SKOV3和BT474）多球体荧光强度的损失。HER-2阳性多球的ADCC免疫细胞杀伤的动态量化。肿瘤细胞接种于96孔平底板的Matrigel上（1000细胞/孔），形成多球（MS）3天。一旦形成，MS与新鲜分离的PBMCs（E:T，5:1）共培养，并用连续稀释的赫赛汀处理。时间进程显示多球体的死亡，通过球体明场目标内荧光强度的损失进行量化。赫赛汀的浓度响应曲线显示HER2阳性多球体（SKOV3和BT-474）之间的敏感性差异。激活的T细胞群（抗CD3和IL-2，10 ng/mL）处理，导致了所有细胞类型的最大MS细胞毒性。每隔6小时收集数据，总计10天。每个数据点代表平均值±SEM，n=4孔。