TEMPO氧化纤维素纳米纤维中糖和葡萄糖醛酸检测方案(液相色谱仪)

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ApplicationNews Newshttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2021年3月400-650-0439 ApplicationNews 高效液相色谱仪 Nexera 还原糖分斤系统 同时分析 TEMPO 氧化纤维素纳米纤维的成分糖和葡萄糖醛酸 01-00022-CN 周毅婷、森田Azusa 对用户的好处 可同时分析 TEMPO 氧化纤维素纳米纤维的主要成分糖和葡萄糖醛酸。 利用柱后荧光衍生化法进行检测，可以高灵敏度选择性定量糖类。 简介 纤维素纳米纤维 (CNF) 通过机械处理木质纸浆(纤维直径20-30 um、纤维长度0.5-3mm) 获得。但是，木质纸浆中的CNF 与 CNF 之间形成氢键，因此，在结晶最小尺寸(纤维直径3-4nm)时，仅通过机械处理可能导致纳米化无法充分达到，或对CNF的损伤变大，需要更大能量进行纳米化，这些都是存在的问题。 据报告，东京大学矶贝明主任教授等组成的团队利用 TEMPO(2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基)实现了纤维素的纳米纤维化，正在进行量产。应用新闻01-00023-JP曾向您介绍了利用 NexeraTM还原糖分析系统分析各种 CNF 成分糖的案例，本文将向您介绍同时分析 TEMPO 氧化 CNF 的成分糖和利用 TEMPO 催化生成的葡萄糖醛酸的案例。 TEMPO 氧化纤维素纳米纤维 纵观 CNF的量产化，降低纳米化所需能量的其中一个方法是在机械处理前将离子性官能团导入木材纸浆中的纳米纤维晶体表面。通过导入离子性官能团，在 CNF 之间获得水的渗透压效应和静电排斥效应，通过水中的简单机械处理可实现纳米化。 图1 TEMPO 氧化 CNF 图 2 TEMPO 氧化 CNF的结构模型 在 TEMPO 氧化 CNF中， 使用 TEMPO 催化剂将部分羟基进行羧基化(图1)”。 仅纤维素微纤维表面露出的部分、葡萄糖的C6位羟基通过TEMPO 催化氧化转化为羧基的钠盐。结果可均匀地获得 CNF (图 2)?o 导入的羧基量对于获得均质 CNF 很重要。羧基量的测定包括电导滴定或 NMR测定等3)4)，本文探讨了同时分析成分糖和葡萄糖醛酸。 前处理方法 测定所用样品如表1所示，加水分解处理样品的步骤如图3所示。 表1测定样品 序号 样品 1 Tempo 氧化CNF-1 2 Tempo 氧化 CNF-2 3 Tempo 氧化纤维素 1.冻干所有样品均已冻干。2.一级水解 将约0.03g的样品转移到25mL 的试管中。将 300 uL的72%硫酸加入试管中。将试管浸入30℃水浴中约1小时。每15分钟用涡旋混合器或玻璃棒混合，使样品完全溶解。 3.二级水解 将8.4 mL超纯水加入试管中，并混匀。将试管在120℃的高压灭菌器中功热60分钟。 4.中和 用玻璃纤维滤纸过滤，用10mL纯水稀释。用 pH试纸检查 pH值时，加入饱和的氢氧化钡水溶液*，中和*，并盐析出硫酸。 5.过滤和稀释 用孔径为 0.2 um 的膜过滤器进行过滤。用乙腈”进行稀释。 *1：将8g八水氢氧化钡溶解在100 mL 的超纯水中。*2，*3：比率和放大倍数因样品而异。见表2。 不同样品的中和条件和糖的浓度不同，各样品的条件如表2所示。此外，考虑到样品溶剂对于峰形的影响，采用乙腈作为稀释溶剂。 表2预处理的中和条件 样品 样品：饱和氢氧化钡水溶液(v/v) pH 稀释比 1 600：300 3 4 2 600：300 5 4 3 500：500 3 8 1分析条件 测定水解处理后样品的分析条件如表3所示。分离色谱柱采用氨基修饰的聚合物类色谱柱 Asahipak NH2P-50。氨基修饰色谱柱因形成席夫碱类引起的二次相互作用，发生阿拉伯糖和甘露糖的吸附，存在无法获得峰强度的问题。因此，为抑制席夫碱类的吸附，采用了添加磷酸的流动相。使用该条件测定糖类标准溶液的色谱图如图4所示。 表3分析条件 图4标准溶液的色谱图(各500 pmol/L) 标准曲线的线性 根据标准溶液的分析结果创建的标准曲线如图5所示。标准曲线的范围为10-1000 umol/L。所有糖均得到了判定系数r=0.9999 以上的良好线性。 图5各化合物的标准曲线 TEMPO 氧化 CNF 的测定 按照图3对各样品进行预处理，利用 Nexera 还原糖分析系统分析时的色谱图如图6~8所示。利用柱后荧光衍生化反应，可以高灵敏度选择性检测糖类。 图6样品1的色谱图 图7样品2的色谱图 图8样品3的色谱图 成分糖的比率 根据已检测糖类的定量值，按照与应用新闻 01-00023-JP相同的方法，进行回收率试验、过分解校正和多糖换算。累计值为100时的各糖及葡萄糖醛酸的构成比如图9所示。可以看出已检测出由TEMPO 催化生成的葡萄糖醛酸。 Nexera 是岛津制作所株式会社在日本及其他国家的商标。 Asahipak 是昭和电工株式会社的注册商标。 分析结束时的注意事项 在本文的分析条件下，采用有机溶剂作为流动相，采用含高浓度盐的水溶液作为反应液。若在分析后立即停止供液，会导致因盐分析出引起的管路堵塞等问题。本分析的结束步骤如下所示。 1 分析结束后，关闭化学反应槽的加热器。保持分析时的流量，继续供应流动相和反应液，直至槽内温度降至100℃以下。 2. 化学反应槽的温度下降后，将流动相、反应液的流量同时变更为0.2mL/min， 冷却至室温。 3. 色谱柱冷却后，立即拆下色谱柱。将流动相和反应液变更为超纯水。以1 mL/min 的流量供应15分钟左右，使用超纯水清洗整体流路。 4. 长时间(1个月以上)未使用时，使用甲醇或乙醇替换除色谱柱之外的整体流路。 结论 利用 Nexera 还原糖分析系统，通过测定经水解处理的TEMPO氧化 CNF的糖类，掌握了成分糖的比率。同时分析了由TEMPO 催化生成的葡萄糖醛酸。 ( <致谢> ) 东京大学矶贝明教授、斋藤继之副教授、藤泽秀次助教为本分析方法的开发和样品提供等提供了很多建议。在此致以最诚挚的感谢。 ( <参考文献> ) ( 1) T. Saito， Y. Nishiyama，J.- L . Putaux， M. Vignonn， A. Is o gai， Biomacromolecules， 2 006， 7 (6)， 1687-1691. ) ( 2 A. Isogai ， The Society of Polymer Science， Japan， vol 58 ， Feb， 2009 3 ) ( Tamura N，. Wada， M.， & Isogai，A.(2009) . TEMPO-mediated oxidation of (1 →3)-B-glucans. C arbohydrate Polymers， 77，300- 305 ) ( 4 Saito， T.， & Isogai， A.(2004). TEMPO-mediated oxidation of native cellulose. The Effec t o f Oxidation Conditions on Chemical and Crystal Structures of the Water-Insoluble Fractions，Biomacromolecules， 5 ， 1983-1989 ) 岛津应用云 ( 免责声明： ) 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 纤维素纳米纤维（CNF）通过机械处理木质纸浆（纤维直径20–30 μm、纤维长度0.5–3 mm）获得。但是，木质纸浆中的CNF与CNF之间形成氢键，因此，在结晶最小尺寸（纤维直径3-4 nm）时，仅通过机械处理可能导致纳米化无法充分达到，或对CNF的损伤变大，需要更大能量进行纳米化，这些都是存在的问题。利用Nexera还原糖分析系统，通过测定经水解处理的TEMPO氧化CNF的糖类，掌握了成分糖的比率。同时分析了由TEMPO催化生成的葡萄糖醛酸。