曲妥珠单抗中曲妥珠单抗药物N糖检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA20-575Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-035 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 利用超高效液相色谱仪连接荧光检测器和四极杆飞行时间质谱仪对曲妥珠单抗访离N糖进行分离与鉴定 LCMS-QTOF-035 摘要：本文利用岛津超高效液相色谱仪 Nexera LC-40XR 连接荧光检测器 RF-20A XS 及四极杆飞行时间质谱 LCMS-9030 联用系统建立了单抗游离N 糖的分离与鉴定方法，对曲妥珠单抗的N 糖进行了定性与定量分析。 该方法使用 PNGaseF 酶将N糖从单抗中释放出来，并利用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)进行标记，之后使用荧光检测器RF-20A XS与四极杆飞行时间质谱 LCMS-9030 进行检测，荧光检测器的峰面积用于N糖的相对定量，高分辨质谱得到的精确质量数可对各峰进行定位。连续进样6针，色谱中所有峰的峰面积和保留时间的RSD均小于3%，质谱中各糖型的质量数偏差均小于2 ppm，最后通过峰面积计算出了各个糖型的丰度比。该方法稳定可靠，峰面积和保留时间的重复性及质量准确度均符合要求。 关键词：RF-20AXSLCMS-9030 Nexera LC-40XR单克隆抗体 游离N糖 在众多的蛋白质翻译后修饰中，糖基化修饰是最重要和最复杂的修饰之一，也是评价抗体的关键质量属性之一。根据糖基化的修饰位点可将糖基化分为N位糖基化和○位糖基化。动物细胞分泌的免疫球蛋白中N位的糖基化是最普遍的糖基化修饰，同时也是研究最多的一种糖基化修饰。以IgG1为例，其重要的糖基化修饰位点位于Fc端，且根据其末端精细结构(长度、分支及单糖排列)的不同又可分为复合型、杂合型和高甘露糖型。 单抗药物功能的实现与其糖基化修饰密切相关，糖基化修饰会影响蛋白的性能，如构象、稳定性、溶 解度、药物代谢动力学、活性及免疫原性等。2020版《中国药典》第三部新增了《3130-单抗N糖谱测定法》，作为指导原则，进一步完善了生物制品全过程质量控制的要求。 本文利用岛津超高效液相色谱仪 Nexera LC-40XR连接荧光检测器 RF-20A XS以及四极杆飞行时间质谱LCMS-9030 建立了单抗游离N糖的分离与鉴定方法，对曲妥珠单抗的N 糖进行了定性与定量分析，方法稳定可靠，峰面积和保留时间重复性及质量数准确度均符合要求，分析检测方法供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津超高效液相色谱仪连接荧光检测器和四极杆飞行时间质谱。具体配置为： 系统控制器：CBM-40lite 脱气机： DGU-403 输液泵： LC-40AB XR自动进样器： SIL-40CXR柱温箱：CTO-40C质谱仪：LCMS-9030 荧光检测器：RF-20A XS 色谱工作站：LabSolutions LCMS Ver. 5.99 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：酰胺基键合硅胶填充色谱柱，150 mm x 2.1 mml.D.， 1.7 um 流动相：A相-50mM甲酸铵水溶液B相-乙腈 流速： 0.5mL/min 柱温：60℃ 进样量：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为78%，时间程序见表1 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 38.5 Pump B.Conc 55.9 39.5 Pump B.Conc 20.0 44.5 Pump B.Conc 20.0 46.5 Pump B.Conc 78.0 60.0 Controller Stop 荧光检测器条件： 激发波长：330nm 数据速率：1pts/s 发射波长：420nm 增益：1 LCMS-9030 质谱条件： 离子源： ESI 接口电压：4.0kV 雾化气流速： 3 L/min 加热模块温度：350℃ DL温度：250℃ 加热气流速：10.0L/min 接口温度：400℃ 干燥气流速：10.0L/min 扫描模式：MS扫描 扫描范围：500-2500m/z 1.3前处理方法 1)N糖的酶切 准备 30 kD 的超滤离心管，加入150 uL 的超纯水，13500g离心5分钟(舍弃残留有大体积液体的超滤管，并处理新的超滤管)。加入200 uL 10 mg/mL 的样品溶液至超滤管中，13500g离心10分钟，丢弃下层液体。向上层截留溶液中加入400 uL 10 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液 (PBS， pH7.4)， 13500g离心10分钟，重复两次，吸取全部上层截留溶液转移至离心管中。吸取 150 uL 10 mmol/L 的 PBS润洗上层超滤管，并转移至对应的离心管中(浓度约为10 mg/mL)。取25 uL 置换 PBS后的溶液，加入5uLN糖苷酶 F (PNGase F) 和 70 uL10mmol/L 的 PBS， 总体积为100 pL，混匀并短暂离心，37℃水浴下孵育20小时。 2)蛋白去除和N糖的标记 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB标记溶液)的制备：取350 uL二甲基亚砜 (DMSO) 和 150 uL乙酸，混匀。精密称取 25 mg 2-AB加入上述溶液中，充分溶解。精密称取 30 mg氨基硼氢化钠加入上述溶液中，充分溶解(可适当加热) 向酶切完的溶液中加入三倍体积预冷的乙醇，涡旋混匀，-20℃放置1小时，沉淀蛋白。13500g离心10分钟。吸取适量(如360uL)上清液至离心管中离心干燥。待完全干燥后，加入10 pL 2-AB标记溶液，涡旋混匀并短暂离心，65℃下孵育2~4小时。 3)标记的N糖纯化 标记的N糖纯化采用固相萃取，按照说明书进行操作，对标记的N 糖进行纯化，以去除游离的2-AB，离心干燥纯化的样品，用100 uL 70%乙腈溶液复溶。 结果与讨论 2.1 Nexera LC-40 连接 RF-20A XS 连续进样重复性考察 按照前处理方法1.3对曲妥珠单抗上连接的N糖进行酶切，酶切下来的游离N糖进样分析，结果如图1所示。对仪器的连续进样差异性进行评估，结果如表2显示，连续进样6针，所有峰的峰面积和保留时间的 RSD均小于3%，仪器及方法重复性良好，可用于对N糖的相对定量。 图1曲妥珠单抗N 糖连续进样色谱图 表2 曲妥珠单抗N 糖峰面积及保留时间连续进样重复性(n=6) 峰号 峰面积 保留时间 平均峰面积 标准偏差 RSD% 平均保留时间(min) 标准偏差 RSD% 峰1 52371 1086 2.075 10.699 0.004 0.036 峰2 48913 1144 2.339 12.433 0.005 0.039 峰3 169913 3854 2.268 12.821 0.005 0.042 峰4 1278049 28948 2.265 14.405 0.006 0.043 峰5 389980 3491 0.895 17.150 0.008 0.045 峰6 121318 945 0.779 17.570 0.008 0.045 峰7 30887 497 1.609 20.124 0.008 0.041 2.2四极杆飞行时间质谱 LCMS-9030 确认曲妥珠单抗样品N糖结构信息 对主要的色谱峰使用高分辨质谱进行结构确认，鉴定出包括 G0-GN， G0F-GN， G0， GOF， G1Fa/b， G2F等七种标记的N糖，如图2所示。图3展示了2-AB标记N糖的理论结构，表3列出了LCMS-9030 所得到实际质量数与理论质量数的误差，结果显示，质量误差均在2ppm以内，质量数准确度符合要求。 图22曲妥珠单抗2-AB标记N糖的总离子流图 图3曲妥珠单抗2-AB标记N糖的理论结构 (GN=GlcNA) 表3曲妥珠单抗N 糖分析质量准确度 2-AB N-glycan 实测质量 m/z 理论质量 m/z 质量误差 ppm G0-GN 1234.4823 1234.4832 -0.729 GOF-GN 1380.5420 1380.5411 0.652 G0 1437.5629 1437.5625 0.278 GOF 1583.6214 1583.6205 0.568 G1Fa/b 1745.6740 1745.6733 0.401 G2F (z=2) 954.3679 954.3667 1.276 2.3N糖的相对定量 使用高分辨质谱对糖型进行表征后，如图4所示，可对荧光检测器中的各峰进行归属，并通过峰面积确认各个糖型的丰度比，结果如图5所示，在所有糖型中，GOF 是占比最高的糖型，比例约为61%。 mV_ 图4 曲妥珠单抗2-AB标记N糖荧光色谱图 图5 曲妥珠单抗2-AB标记各N糖型的相对丰度 结论 本文利用岛津超高效液相色谱仪 Nexera LC-40XR连接荧光检测器 RF-20A XA 和四极杆飞行时间质谱LCMS-9030 建立了单抗游离N 糖的分离与鉴定方法，对曲妥珠单抗的N 糖进行了定性与定量分析，连续进样6针，色谱中所有峰的峰面积和保留时间的 RSD 均小于3%，质谱中各糖型的质量数偏差均小于2 ppm， 最后通过峰面积计算出了各个糖型的丰度比。方法稳定可靠，峰面积、保留时间及质量数准确度均符合要求，可供相关检测人员参考。 岛津应用云 本文利用岛津超高效液相色谱仪Nexera LC-40XR连接荧光检测器RF-20A XS及四极杆飞行时间质谱LCMS-9030联用系统建立了单抗游离N糖的分离与鉴定方法，对曲妥珠单抗的N糖进行了定性与定量分析。该方法使用PNGaseF酶将N糖从单抗中释放出来，并利用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）进行标记，之后使用荧光检测器RF-20A XS与四极杆飞行时间质谱LCMS-9030进行检测，荧光检测器的峰面积用于N糖的相对定量，高分辨质谱得到的精确质量数可对各峰进行定位。连续进样6针，色谱中所有峰的峰面积和保留时间的RSD均小于3%, 质谱中各糖型的质量数偏差均小于2 ppm，通过峰面积计算出了各个糖型的丰度比。该方法稳定可靠，峰面积和保留时间的重复性及质量准确度均符合要求。