人血清中20种抗癫痫药物含量检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA22-054Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-620 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 检测人血清中20种抗癫痫药物含量 LCMSMS-620 摘要：本文建立了一种使用岛津液相相谱质谱联用仪测定人血清中20种抗癫痫药物的定量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能。结果显示各分析物线性范围内标准曲线相关系数均大于0.9978，方法准确度偏差在-5.3%~9.3%之间，精密度 RSD 均小于11.86%，可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 关键词：临床检测LC-MS/MS抗癫痫药物 癫痫病在我国又被称为“羊角风”，是一种慢性脑功能障碍综合征，多发病于儿童时期，发病后若不及时控制可留下脑损伤后遗症，影响智力发育。目前临床上常用的抗癫痫药物有丙戊酸钠、左乙拉西坦、奥卡西平等，这些药物大多治疗窗较窄，个体差异较大，不同的癫痫病患者对各种抗癫痫药物的敏感度不同，为了有效控制和治疗癫痫病情，减少毒副作用，神经精神药理学与药物精神病学协会 (AGNP)的专家强烈推荐在抗癫痫药使用过程中开展血药浓度监测，这样可以帮助医生制订个体化给药方案，实现精准治疗，降低用药风险。 关于抗癫痫药物浓度监测的方法有免疫检测法、原子吸收法、色谱法，由于生物基质的复杂性，上述方法在抗干扰能力、灵敏度和检测通量方面有一定局限性，为了进一步提高检测的准确度和灵敏度，越来 实验部分 越多的医院和第三方医学检测中心逐步开发出用于抗癫痫药物浓度监测的液相色谱串联质谱法。 目前市场上治疗癫痫的药物种类繁多，为了提高检测的准确度和灵敏度，并同时满足抗癫痫药物检测的广谱性需求，本文参考中国医师协会检验医师分会临床质谱检验医学专业委员会的《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》，基于岛津 LCMS-8045 平台建立了一种简单高效的液相色谱质谱法同时测定人血清中抗癫痫药物的定量分析方法。 血清样本经蛋白沉淀和引入同位素内标后加水适当稀释后直接进样分析，内标法定量人血清中药物含量。该方法方便、快捷，只需1针进样，5分钟内完成分析，实现了20种常见抗癫痫药物的同时快速分析，大大提高了分析效率和检测通量，能满足临床样本的联合检测需求，供相关人员参考。 输液泵： LC-40B X3 检测器：LCMS-8045 自动进样器：SIL-40C X3 系统控制器： SCL-40 柱温箱： CTO-40S 表1 梯度洗脱程序 时间(min) A (%) B(%) 工作站软件：LabSolutions Version 5.99 1.2分析条件 0.30 60 5 液相色谱条件 1.00 85 15 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18(50 mm × 2.1mm×1.8 um)， 1.50 85 15 货号：227-32001-02 2.00 55 45 流动相：A相-水，B相-乙腈 2.50 55 45 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5% 3.00 5 95 时间程序见表1 3.50 5 95 流速：0.4mL/min 3.60 95 5 柱温：40℃ 进样器温度：15℃ 5.00 95 5 进样器温度：15℃ 进样量：2uL 质谱条件 离子化模式： ESI离子源温度：300℃加热气：空气10.0 L/minDL管温度：200℃雾化气：氮气3.0 L/min加热模块温度：400℃干燥气：氮气10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)驻留时间： 15 msMRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 1.3样品制备和前处理 1.3.1标准品&内标信息 表3 标准品信息 ID 中文名 英文名 CAS/EC 号 1 丙戊酸 Valproic Acid 99-66-1 2 丙戊酸镁 2-propylpentanoate Acid Magnesium 62959-43-7 3 丙戊酸钠 2-propylpentanoic Acid Sodium 1069-66-5 4 卡马西平 Carbamazepine 298-46-4 5 卡马西平10，11-环氧化物 Carbamazepine-Epoxide 36507-30-9 6 10，11-二氢-10-羟基卡马西平 Carbamazepine-Dihydro 29331-92-8 7 拉莫三嗪 Lamotrigine 84057-84-1 8 苯妥英钠 Phenytoin 57-41-0 9 左乙拉西坦 Levetiracetam 102767-28-2 10 奥卡西平 Oxcarbazepine 28721-07-5 11 托吡酯 Topiramate 97240-79-4 12 苯巴比妥 Phenobarbital 50-06-6 13 扑米酮 Primidone 125-33-7 14 乙琥胺 Ethosuximide 77-67-8 15 加巴喷丁 Gabapentine 60142-96-3 16 普瑞巴林 Pregabalin 148553-50-8 17 卢非酰胺 Rufinamide 106308-44-5 18 司替戊醇 Stiripentol 49763-96-4 19 拉考沙胺 Lacosamide 175481-36-4 20 吡仑帕奈 Perampanel 380917-97-5 表4内标信息 ID 中文名 英文名 CAS/EC 号 丙戊酸-D， Valproic Acid-D6 87745-18-4 2 卡马西平-D Carbamazepine-D10 132183-78-9 3 拉莫三嗪-13c，15N， Lamotrigine-13c，15N。 200-659-6 4 苯妥英-D Phenytoin-D1o 65854-97-9 5 左乙拉西坦-D， Levetiracetam-D 1133229-30-7 6 奥卡西平-c Oxcarbazepine-c， NA 7 托吡酯-D， Topiramate-D12 1279037-95-4 8 苯巴比妥-D， Phenobarbital-D 72793-46-5 9 扑米酮-D， Primidone-D， 73738-06-4 10 乙琥胺-D： Ethosuximide-D， 1189703-33-0 11 加巴喷丁-D1o Gabapentin-D10 1126623-20-8 12 普瑞巴林-c， Pregabalin-3c， 1189980-48-0 13 卢非酰胺-15N，D， Rufinamide-15N，D， NA 14 司替戊醇-D。 Stiripentol-D， 1185239-64-8 15 拉考沙胺 - C，Ds Lacosamide-c，D 200-835-2 16 吡仑帕奈-13c Perampanel-c， NA 1.3.2样本制备 (1)内标萃取液：分别移取内标储备液于25mL容量瓶中，加入乙腈溶液定容得到内标萃取液(各化合物浓度为 0.083~5.00 ug/mL)； (2)校准品：分别移取标准品储备液于2mL容量瓶中，加入正常人血清定容得到6个浓度的人血清基质校准品(各化合物浓度如表5所示))； (3)质控品：分别移取标准品储备液于2mL容量瓶中，加入正常人血清定容得到2个浓度的人血清基质质控品(各化合物浓度如表5所示)。 表5 校准品&质控品浓度信息 化合物 校准品(ug/mL) 质控品 (ug/mL) STD1 STD2 STD3 STD4 STD5 STD6 LQC HQC 丙戊酸 2.40 4.80 7.20 24.00 48.00 120.00 12.00 60.00 卡马西平 0.40 0.80 1.20 4.00 8.00 20.00 2.00 10.00 卡马西平10，11-环氧化物 0.20 0.40 0.60 2.00 4.00 10.00 1.00 5.00 10，11-二氢-10-羟基卡马西平 0.80 1.60 2.40 8.00 16.00 40.00 4.00 20.00 拉莫三嗪 0.40 0.80 1.20 4.00 8.00 20.00 2.00 10.00 苯妥英钠 0.50 1.00 1.50 5.00 10.00 25.00 2.50 12.50 左乙拉西坦 1.00 2.00 3.00 10.00 20.00 50.00 5.00 25.00 奥卡西平 0.80 1.60 2.40 8.00 16.00 40.00 4.00 20.00 托吡酯 0.32 0.64 0.96 3.20 6.40 16.00 1.60 8.00 苯巴比妥 1.00 2.00 3.00 10.00 20.00 50.00 5.00 25.00 扑米酮 0.50 1.00 1.50 5.00 10.00 25.00 2.50 12.50 乙琥胺 2.40 4.80 7.20 24.00 48.00 120.00 12.00 60.00 加巴喷丁 0.50 1.00 1.50 5.00 10.00 25.00 2.50 12.50 普瑞巴林 0.20 0.40 0.60 2.00 4.00 10.00 1.00 5.00 卢非酰胺 0.80 1.60 2.40 8.00 16.00 40.00 4.00 20.00 司替戊醇 0.30 0.60 0.90 3.00 6.00 15.00 1.50 7.50 拉考沙胺 0.40 0.80 1.20 4.00 8.00 20.00 2.00 10.00 吡仑帕奈 0.04 0.08 0.12 0.40 0.80 2.00 0.20 1.00 1.3.3样本前处理 (1)移取10uL校准品/质控品/待测血清样本于1.5mL离心管； (2)加入60 uL内标萃取液于2000 rpm 涡旋混合1 min； (3))]10000 rpm 4℃离心5 min； 取50 uL上清于进样小瓶并加入400 uL 纯水混匀； 上机后自动进样器以2 uL进样分析。 实验结果 2.1临床参考区间 表6 临床参考区间 ID 名称 有效浓度(ug/mL) 警戒浓度 (ug/mL) 1 卡马西平 4-12 20 2 10，11-二氢-10-羟基卡马西平 10-35 40 3 卡马西平10，11-环氧化物 0.5 9.57 4 乙琥胺 40-100 120 5 加巴喷丁 2-20 25 6 拉考沙胺 0.87 20 7 拉莫三嗪 3-15 20 8 左乙拉西坦 10-40 50 9 奥卡西平 10-35 40 10 吡仑帕奈 0.097 1.46 11 苯巴比妥 10-40 50 12 苯妥英钠 10-20 25 13 普瑞巴林 2-5 10 14 扑米酮 5-10 25 15 卢非酰胺 5-30 40 16 司替戊醇 1-10 15 17 托吡酯 2-8 16 18 丙戊酸 50-100 120 *数据来源于 AGNP 指南(2017) 和 RECIPER 试剂盒。 2.2线性关系 将6个标准浓度的校准品按1.3.3中前处理条件进行分析测定，以浓度比为横坐标，面积比为纵坐标，内标法制作校准曲线得到相关系数、线性范围和校准品准确度见表7。 表7 标准曲线参数 # 名称 相关系数 线性范围 (ug/mL) 准确度(%) Carbamazepine 0.9999 0.4-20 88.3~113.2 Carbamazepine-Dihydro 0.9997 0.8-40 90.6~110.8 3 Carbamazepine-Epoxide 0.9988 0.2-10 89.7~113.8 4 Ethosuximade 0.9998 2.4-120 86.2~110.5 5 Gabapentine 0.9999 0.5-25 95.7~105.5 6 Lacosamide 1.0000 0.4-20 95.1~103.5 7 Lamotrigine 0.9999 0.4-20 91.5~114.2 8 Levetiracetam 1.0000 1-50 95.4~105.6 9 Oxcarbazepine 0.9994 0.8-40 94.2~108.3 10 Perampanel 1.0000 0.04-2 94.4~106.6 11 Phenobarbital 0.9978 1-50 85.2~112.1 12 Phenytoin 0.9986 0.5-25 85.7~114.7 13 Pregabaline 1.0000 0.2-10 96.9~105.3 14 Primdone 0.9995 0.5-25 91.8~110.6 15 Rufinamide 0.9999 0.8-40 95.8~104.2 16 Stiripentol 0.9998 0.3-15 86.5~112.3 17 Topiramate 0.9987 0.32-16 87.9~114.6 18 Valproic Acid 0.9999 2.4-120 90.1~108.2 2.3精密度&准确度实验 本实验分别对低浓度和高浓度的正常人血清基质加标样(质控品)进行6次重复测定，精密度相对标准偏差范围分别在1.37%~11.86%(LQC) 和0.91%~9.19%(HQC)之间，准确度度相对标准偏差范围分别在-5.3%~9.3%(LQC)和-3.4%~2.6%(HQC)之间，满足临床检测要求，数据结果见附录表8和表9。 表8 LQC精密度&准确度结果(n=6) # Sample Mean(ng/mL) %RSD Target(ng/mL) %Dev 1 Carbamazepine 1.97 3.74 2.00 -1.5% 2 Carbamazepine-Dihydro 3.96 3.90 4.00 -1.0% 3 Carbamazepine-Epoxide 0.98 4.49 1.00 -2.0% 4 Ethosuximade 13.12 7.09 12.00 9.3% 5 Gabapentine 2.42 1.37 2.50 -3.2% 6 Lacosamide 2.05 1.83 2.00 2.5% 7 Lamotrigine 2.02 2.73 2.00 1.0% 8 Levetiracetam 4.75 1.51 5.00 -5.0% 9 Oxcarbazepine 3.79 2.01 4.00 -5.3% 10 Perampanel 0.21 2.64 0.20 5.0% 11 Phenobarbital 4.90 6.38 5.00 -2.0% 12 Phenytoin 2.49 7.80 2.50 -0.4% 13 Pregabaline 1.00 2.74 1.00 0.0% 14 Primdone 2.52 6.69 2.50 0.8% 15 Rufinamide 3.94 2.51 4.00 -1.5% 16 Stiripentol 1.52 11.86 1.50 1.3% 17 Topiramate 1.68 10.02 1.60 5.0% 18 Valproic Acid 11.84 4.10 12.00 -1.3% 表9HQC精密度&准确度结果 (n=6) # Sample Mean(ng/mL) %RSD Target(ng/mL) %Dev 1 Carbamazepine 9.76 4.95 10.00 -2.4% 2 Carbamazepine-Dihydro 19.78 5.61 20.00 -1.1% 3 Carbamazepine-Epoxide 4.91 5.33 5.00 -1.8% 4 Ethosuximade 60.69 4.42 60.00 1.2% 5 Gabapentine 12.31 1.11 12.50 -1.5% 6 Lacosamide 10.26 0.91 10.00 2.6% 7 Lamotrigine 9.93 3.85 10.00 -0.7% 8 Levetiracetam 24.45 1.86 25.00 -2.2% 9 Oxcarbazepine 19.84 2.41 20.00 -0.8% 10 Perampanel 0.98 3.76 1.00 -2.0% 11 Phenobarbital 24.16 9.19 25.00 -3.4% LCMSMS-620 12 Phenytoin 12.61 4.36 12.50 0.9% 13 Pregabaline 5.07 1.18 5.00 1.4% 14 Primdone 12.42 1.93 12.50 -0.6% 15 Rufinamide 20.05 1.20 20.00 0.3% 16 Stiripentol 7.25 4.36 7.50 -3.3% 17 lopiramate 8.04 3.07 8.00 0.5% 18 Valproic Acid 58.24 3.17 60.00 -2.9% 2.4低浓度质控品色谱图 LCMSMS-620 结论 建立了一种使用岛津质谱 LCMS-8045 测定人血清中20种抗癫痫药物的定量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能。结果显示各分析物线性范围内标准曲线相关系数均大于0.9978，精密度相对标准偏差范围分别在1.37%~11.86%(LQC)和0.91%~9.19%(HQC)之间，准确度度相对标准偏差范围分别在-5.3%~9.3% (LQC) 和-3.4%~2.6%(HQC)之间，可满足临床日常检验需求。 岛津应用云 建立了一种使用岛津质谱LCMS-8045测定人血清中20种抗癫痫药物的定量分析方法。利用蛋白沉淀的前处理方法，以内标法建立标准曲线，线性范围涵盖临床参考区间，分别考察了方法的线性、准确度和精密度性能。结果显示各分析物线性范围内标准曲线相关系数均大于0.9978，精密度相对标准偏差范围分别在1.37%~11.86%（LQC）和0.91%~9.19%(HQC)之间，准确度度相对标准偏差范围分别在-5.3%~9.3%（LQC）和-3.4%~2.6%(HQC)之间，可满足临床日常检验需求。