饲料中黄曲霉毒素B族和G族检测方案(固相萃取仪)

智能文字提取功能测试中

自动化样品前处理解决方案-RK-2021 解决方案 全自动固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素B族和G族 介自动固相萃取；全自动均质器；高效液相色谱法；黄曲霉毒素；饲料 本文参考GB/T 30955-2014 《饲料川黄曲霉霉毒B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》 ，试样采用80%甲醇水溶液提取，提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱经RAYKOL FOTECTOR PLUS全自动固相萃取仪净化。用20ML超纯水淋洗柱了除去杂质，最后以甲醇洗脱，高效液相色谱检测，外标法定量。添加上机浓度为5NG/ML的加标实验，得到四种黄曲霉毒索的加标回收率在82%-109%之间， RSD值小丁5%， 表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中黄曲霉毒素的检测亨求。 全自动固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素B族和G族 1.介绍 饲料中的黄曲霉毒素是黄曲霉群真菌的一系列代谢产物的总称，对大多数动物都有强烈的毒性作用。主要是改变饲料的适口性，降低饲料的营养价值，影响动物繁殖机能，导致动物繁殖机能紊乱，还具有免疫毒性、肝毒性，可造成畜禽大批死亡及强烈的致癌作用。 图-1.4种黄曲霉毒素的结构式 本文参考 GB/T 30955-2014 《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》，试样采用80%甲醇水溶液提取，提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱经 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪净化。用20 mL 超纯水淋洗柱子除去杂质，最后以甲醇洗脱，高效液相色谱检测，外标法定量。添加上机浓度为 5 ng/mL 的加标实验，得到四种黄曲霉毒素的加标回收率在 82%-109%之间， RSD 值小于5%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中黄曲霉毒素的检测需求。 关键字：全自动固相萃取；；全自动均质器；高效液相色谱法；黄曲霉毒素；饲料 2.仪器、耗材 全自动固相萃取仪：：睿科Raykol Fotector Plus 全自动液体处理工作站：睿科 Raykol Auto Prep 200 全自动均质器：睿科 Raykol AH-50 高效液相色谱： Waters ACQUITY UPLC I-Class 配备大体积流通池 黄曲霉毒素免疫亲和柱 (Romer， 500ng/3mL) 甲醇(Merck，色谱纯)、乙腈(Merck，色谱纯)、吐温-20 (Sigma，试剂纯)、超纯水、 PBS 盐包 3.标准曲线配置 使用睿科 Raykol Auto Prep-200 可实现标准品的全自动化配制，可将混合标液(1000 ug/L)通过工作站的直接稀释模式，配制一条浓度分别为 0.5 ug/L， 1.0 ug/L， 5.0ug/L， 10 ug/L 和50 ug/L 的标准工作曲线。 图-1. Auto Prep 200 液体工作站配标程序 4.样品提取与净化 4.1样品提取 准确称取 50 g 试样于 200 mL 离心管中，加入5g氯化钠及100 mL 甲醇-水溶液(8：2)(v/v)，用睿科 AH-50全自动均质器以 18000 r/min 的速度均质 2 min， 然后以10000 r/min 的转速离心5 min， 取10 mL 上清液于80 mL 玻璃上样管中，加入40 mL 0.1%吐温-20的PBS缓冲液混匀，待用。 4.2样品净化 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Fotector Plus 固相萃取柱 黄曲霉毒素免疫亲和柱 (Romer， 60 mg/3 mL) 淋洗 超纯水 洗脱 甲醇 以2 mL/min 的速度精确上样10 mL 待测液，10 mL水清洗样品瓶，10 mL水淋洗免疫亲 和柱，气推压干免疫亲和柱，推速为 80 mL/min。最后用1 mL 甲醇以 0.5mL/min 的速度洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，加入超纯水定容至2mL，涡旋混匀，过0.22pm滤膜上机检测。详细步骤见图-2。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积 时间min， 1 清洗样品通道 H20 2.8 2 填充样品路径 H20 40 3 1.3 3 特殊上样 废水 2 10 5.8 4 清洗样品瓶 H20 废水 80 10 6.2 5 淋洗 H20 废水 3 10 3.9 6 气推 废水 80 30 2.2 7 清洗注射泵 CH30H 80 3 0.4 8 洗脱 CH30H 收集 0.5 1 2.3 9 气推 收集 0.5 2 4.4 10 气推 收集 40 10 1.1 11 结束 12 图-2.Fotector Plus 黄曲霉毒素免疫亲和净化方法 5.检测条件 5.1液相色谱条件 表-2黄曲霉毒素液相色谱检测条件 色谱柱 Waters BEH-C18(2.1×100 mm，1.7 um) 流速 0.300 mL/min 流动相 A：水，B：甲醇 柱温 40°C 进样体积 10 uL 梯度洗脱 等度洗脱 A：B=55：45 荧光检测器 激发波长365nm， 发射波长463nm 5.2色谱图 图-3.四种黄曲霉毒素大流通池检测色谱图(5ug/L) 6.加标测试 取空白试样50g， 添加上机浓度为 5 ng/mL 的黄曲霉毒素 G2、B2、Gi和Bi标准品，进行上述前处理，回收率结果如下表-3所示。 表-3添加实验的回收率及相对标准偏差结果(n=6) 名称 回收率(%) 平均回收 RSD 1 2 3 4 5 6 率(%) (%) AFG2 99.9 97.6 96.2 98.0 92.3 99.4 97.2 2.9 AFB2 94.6 92.0 93.5 94.4 88.0 91.4 92.3 2.7 AFG1 92.0 89.9 87.9 87.5 82.0 81.6 86.8 4.9 AFB1 108.4 104.6 106.7 102.2 100.8 98.9 103.6 3.5 7.注意事项 7.1.由于黄曲霉毒素在紫外光照射下不稳定，因此在实验过程中应该避免紫外光和太阳光的照射。 7.2.免疫亲和柱使用前需提前从冰箱中取出，于25℃回温20分钟左右，冬天室温较低时建议放到温度较高的地方回温。 8.总结 自动处理60个样品，做样通量高；同时可无人值守，大幅度减少了工作人员的工作量，提高了工作效率。此外还可避免工作人员因操作失误导致的检测偏差，也可将实验人员更迭对检测结果的影响最小化。 8.2. 睿科 Raykol Auto Prep 200 全自动液体工作站可实现混标、标准曲线的配置，全程无需人为值守，让实验人员远离有毒有害特别是黄曲霉毒素这样的剧毒化学物质，保护身体健康。 8.3.睿科 Raykol AH-50 全自动均质器采用密封式设计，能有效防止有机溶剂挥发；兼容各种体积的离心管，适配性强；均质完成后可自动进行刀头清洗，避免交叉污染，减少人力耗费。 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 网址：：Vwww.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com热线：址：：vwww.raykol.com 本文参考GB/T 30955-2014 《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》 ，试样采用80%甲醇水溶液提取，提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱经Raykol Fotector Plus全自动固相萃取仪净化。用20 mL超纯水淋洗柱子除去杂质，最后以甲醇洗脱，高效液相色谱检测，外标法定量。添加上机浓度为5 ng/mL的加标实验，得到四种黄曲霉毒素的加标回收率在82%-109%之间，RSD值小于5%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中黄曲霉毒素的检测需求。