白及及其近似饮片中味觉识别检测方案(感官智能分析)

智能文字提取功能测试中

第二十三卷 第五期 ★Vol.23 No.52021 世界科学技术-中医药现代化★中医研究 基于电子舌的白及及其近似饮片的快速辨识研究* 李媛媛'，王艳丽，姚静2.3.4，施钧瀚2.3.4，桂新景2.3.4，张 璐23.4，冯文豪'，张 璞，张慧杰'，李学林2.3.4，刘瑞新2.3.4** (1.河南中医药大学药学院 郑州 450008；2.河南中医药大学第一附属医院药学部郑州3.河南省中药饮片临床应用现代化工程研究中心郑州 450000： 450000： 4.河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心郑州 450000) 摘 要：目的 探讨电子舌方法用于白及及其近似饮片快速辨识的可行性。方法 收集45批白及饮片及其近似品天麻饮片30批、玉竹饮片30批、黄花白及饮片29批，分别进行药典与地方标准辨识(M，法)、HPLC指纹图谱辨识(M，法)，并结合原始采购信息获取最终饮片种类的标杆信息(Y)，再采集电子舌味觉感官数据(X)并利用化学计量学方法分别建立主成分分析-判别分析(PCA-DA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)的45批白及饮片与剩余89批饮片的二分类辨识模型和45批白及饮片、30批天麻饮片、30批玉竹饮片、29批黄花白及饮片的四分类分识模型(Y=F(X)，M，法)。结果 经留一法交互验证，基于PCA-DA、PLS-DA二分类辨识模型的正判率分别为98.51%、100.00%，基于PCA-DA、PLS-DA四分类辨识模型的正判率分别为100.00%(无未分类样本)、100.00%(有4个未分类样本)，模型判别良好，结合正判率与模型未分类样本数两项指标，最终选择二分类辨识以PLS-DA为最终辨识模型、四分类辨识以PCA-DA为最终辨识模型，两种模型正判率均为最高，且均未出现未分类样本。结论 电子舌可快速准确辨识白及及其近似饮片，为未来研发智能化中药饮片快速辨识设备提供了思路。 关键词：白及 电子舌 快速辨识 PCA-DA PLS-DA doi： 10.11842/wst.20201106003 中图分类号：R282.5 文献标识码：A 白及为兰科植物白及 Bletille striata (Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，性味苦、甘涩、微寒，归肺、肝、胃经，临床常用于肺胃出血、皮肤皲裂、疮痈肿毒、外伤出血等"，在化妆品、工业制胶、保健及食品领域也应用较广。白及的应用范围广、药用价值高、用量大，其野生量与栽培量已满足不了市场的需求，且在2015年版中国药典中也未明确规定有效成分和含量，因此同属或相似种植物充伪或掺伪白及的问题尤为突出。 其中市场中同属植物黄花白及、水白及等冒充白及的现象较为常见；天麻、玉竹因与白及具有外表皮黄白色、角质样、半透明等多个相似饮片的性状特征，市场上也有出现玉竹碎片、质量次等的天麻饮片等掺伪白及饮片的情况。目前，白及饮片的真伪鉴别和分类研究多采用白及药典检测方法或其他现代检测方法如光谱指纹图谱法-"、色谱指纹图谱法和基因组学、蛋白质组学等生物鉴别方法13-161，此类方法准确可 ( 修回日期：202 1 -03-21 ) ( 河南省 中 医管理局普通课题(2 0 18ZY2131)：基于智能感官技术及多传感器信息融合的中药饮片快速质量评价方 法 研究，负责人： 刘 瑞新；河南省中医管理局普通课题(2 0 1 8JDZ X087)：基于仿生传感器信息融合的砂仁及山茱萸饮片质量识别关键技术研究，负责人：桂新景；国家 ) 自然科学基金委委会常规面上项目(81774452)：基于多传感器信息融合与多尺度模拟的中药呈苦规律及抑苦机制研究，负责人：李学林。 ( 通讯作者：刘瑞新，主任药师，硕士研究生导师，主要研究方向 ：中 药饮片临床应用现代化关键技术研究。 ) ( 1 532〔 M o de rnization of Traditional Ch i ne s e Me di cine and M a ter ia Medi c a-World Science and T e chnologyJ ) 表1TS-5000Z电子舌传感器简介 传感器名称 可评价的味道 先味(相对值) 回味(CPA值) 酸味传感器(CAO) 酸味(酷酸、柠檬酸、酒石酸等引起的酸味) 无 苦味传感器(C00) 苦味(苦味物质引起的味道) 苦味回味(啤酒、咖啡等呈现的苦味的残留和持久性) 涩味传感器(AE1) 涩味(涩味物质引起的味道、低浓度下感知为刺激性回味) 涩味回味(茶、红酒等呈现的涩味的残留和持久性) 鲜味传感器(AAE) 鲜味(氨基酸、核酸等引起的鲜味) 丰富性(汤、调味汁等含有的可持续性感知的鲜味) 味传感器(CTO) 成味(食盐等无机盐引起的成味) 无 靠，可定性定量表征，重复性也较好，但操作繁琐、耗时较长、技术要求高、可及性差。传统经验辨识主要通过眼观、手试、鼻闻及口尝等方式综合评价中药饮片，但其对鉴别人员水平要求高、主观性强、且难以传承和量化。那么，探索一种快速、精准地鉴别白及饮片真伪及分类的方法就显得尤为重要，现代智能感官技术的出现为此提供了可能。 电子舌(electronic tongue)又称味觉指纹图谱技术，可模拟人类和动物的味觉系统，通过对所测试对象的物质基础的响应获得味觉信号，利用独特的先味与回味测量技术，能够定性、定量分析苦味、甘味、涩味、酸味等指标，可快捷、灵敏、准确、全面地反映中药材的整体味觉特征，已用于中药材的质质评价、药性分析、产地鉴别、掺伪鉴别、炮制品滋味鉴别等18-2。因此，笔者以白及饮片为载体，选取天麻、玉竹、黄花白及作为其近似品4*51，基于电子舌和化学计量学方法对其进行分类辨识，探讨快速准确评价饮片的可行性。 1 仪器与材料 1.1 仪器 Thermo UltiMate 3000高效液相色谱仪、紫外检测器(赛默飞世尔科技有限公司)，万分之一电子天平(BSA2245-CW，Sartorius)，十万分之一电子分析天平(CP225D，Sartorius)，超声波清洗器(HK250，上海科导超声仪器有限公司)，JW-2018H型高速离心机，电子显微镜(LEICA DM1000，上海 LAS V4.0系统)，薄层成像仪(TLC ViSuALi ZER2，瑞士卡玛公司)，电热鼓风干燥箱(GZX-9146MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高温箱型电阻炉(4-13，沈阳市节能电炉厂)，TS-5000Z型电子舌(日本INSENT公司)，电子舌的传 感器介绍见表1。 1.2 材料 白及对照药材(121261-201706，中国食品药品检定研究院)，Militarine (1，4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯)(≥98%，K1809B72711，上海源叶生物科技有限公司)，乙腈(601797-04185，天津市四友精细化学品有限公司)，磷酸(20150302，天津市永大化学试剂有限公司)，纯化水，乙醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，稀甘油(国药准字H20073910，20180708，南昌白云药业有限公司)。实验用45批白及、30批批麻、30批玉竹和29批黄花白及样本分别购自于郑州市5家中医院(河南中医药大学第一附属医院、河南中医药大学第三附属医院、郑州中医骨伤病医院、河南省中医院、天津中医药研究院附属医院)、8家医药公司(安徽人民中药饮片有限公司、安徽德昌药业股份有限公司、安徽普仁中药饮片有限公司、亳州市先锋中药饮片有限公司、亳州市沪药业有限公司、亳州市永刚饮片厂有限公司、四川新荷花中药饮片股份有限公司、郑州瑞龙制药股份有限公司)、成都荷花池药材市场、张仲景大药房等。购进信息：编号1-45为白及饮片，编号46-75为天麻饮片，编号76-105为玉竹饮片，编号106-134为黄花白及饮片。 2方法 2.1 药典与地方标准辨识方法(M法) MI法包括性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别(参照2015年版中国药典一部附录白及项项的方法、2015年版《四川省中药饮片炮制规范》黄花白及 Bletillaochracea Schltr，2009年版《甘肃省中药炮制规范》和2009年版《甘肃省中药材标准》小白及(实为黄花白及Bletilla ochracea Schltr，而非植物学白及属小白及 ( ① 四 川省食品药品监督管理局，四川省中药饮片炮制规范，四川：科技出版社，2015. 5 . ) ( ② 甘肃省卫生局.甘肃 省 中药炮制规范.甘肃：人民出版社，2009 . 12-13. ) ( ③ 甘 肃省食品药品监督管理局，甘肃省中药材标准，甘肃：文化出版社，2009.13-4. ) 〔Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology Bletilla formosana (Hayata) Schltr)项下的性状鉴别方法)加以对比辨识。 2.2 HPLC辨识方法(M，法) 色谱条件：Shim-pack GIST C18-AQ色谱柱；流动相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱(0-5min，5%-20%；5-10 min，20%-24%；10-20 min， 24%-31.5%；20-25min，31.5%-35%；25-30 min，35%-42%；30-45 min，42%-60%)；流速：1.0mL·min；检测波长280 nm；柱温：30℃；进样量10u.L。 2.3 电子舌辨识方法(M，法) 标杆辨识信息(Y)的获取：结合药典与地方标准结果、HPLC指纹图谱对比结果和原始购买饮片信息，共同确定饮片分类的标杆信息。味觉信息矩阵(X)的获取：取1-134号样本粉碎后过6号筛.精密称取2.0g样本粉末置100mL烧杯中，加人适量纯化水，迅速搅拌均匀后，静置5 min，过滤，将上清液转移至100 mL容量瓶中，定容待测。将上述各样本溶液(30mL)分别倒人电子舌专用烧杯中，遵行平衡-测先味值-清洗-测回味值的程序，在室温下进行味觉数据采集。电子舌传感器依次在清洗液中清洗90 s、参比溶液中清洗120s、另一组参比溶液中清洗120s，使传感器归零30s至达到平衡条件后开始采集。每个样本的先味值采集时间为30 s，在两组参比溶液中分别间隔3s时间清洗后，再将传感器插入新的参比溶液中采集30s后输出回味值，如此循环测试4次，去掉第1次循环，取后3次循环的平均数据作为测试结果，最终得到8根传感器味觉信息矩阵X(134×8)； 2.4 二分类辨识模型的建立及优化 以电子舌采集的134个样本的8个味觉信息(134×8)作为自变量；基于药典与地方标准检测、HPLC指纹图谱对比和原始采购信息的综合结果作为标准因变量Y，建立X和Y之间的关系Y=F(X)模型，利用MATLAB矩阵实验室，分别建立134个样本的PCA-DA，PLS-DA二分类辨识模型，辨识结果以留一法交互验证的结果为准。模型构建参考文献21。 2.5 四分类辨识模型的建立及优化 原理同2.4。 2.6 模型(特征变量)与味觉传感器对分类贡献度的追踪 利用MATLAB矩阵实验室建模时，为达到分类效果，二分类辨识模型构建时标杆信息Y的设定：“1”白 及饮片，“2”非白及饮片；四分类辨识模型构建时标杆信息Y的设定：“1”白及饮片，“2”天麻饮片，“3”玉竹饮片，“4”黄花白及饮片；经模型运算后，所得分类结果Y表达意义相同。 2.6.1 基于 Wilk’s lambda 变异度分析与排序 将传感器信息值矩阵X(134×8)及标杆信息Y导人 MATLAB 矩作工作建，建模之前先对变量进行Wilk’s lambda变异度分析，运行程序后得到反映模型特征变量的柱状图。 2.6.2 最优模型潜变量得分图追踪 利用MATLAB矩阵实验室，分别建立PCA-DA、PLS-DA辨识模型后，以正判率最高且无未分类样本的模型为最优，追踪其最优模型的潜变量得分图，找到其反映对于分类结果贡献度最大的传感器。 3 结果 3.1 药典与地方标准辨识(M，法)结果 30批天麻饮片、30批玉竹饮片均不符合2015年版中国药典一部附录白及项下标准，45批白及饮片符合2015年版中国药典一部附录白及项下标准而不符合2015年版《四川省中药饮片炮制规范》、2009年版《甘肃省中药炮制规范》和2009年版《甘肃省中药材标准》黄花白及项下标准，黄花白及饮片(106-120号)既符合2015年版中国药典一部附录白及项下标准，又符合2015年版《四川省中药饮片炮制规范》、2009年版《甘肃省中药炮制规范》和2009年版《甘肃省中药材标准》黄花白及项下标准。最终，二分类判别结果：1-45号样品被判定为“白及饮片”，46-134号样品被判定为“非白及饮片”；四分类判别结果：1-45号样品被判定为“白及饮片”，46-75号样品被判定为“天麻饮片”，76-105号样品被判定为“玉竹饮片”，106-134号样品被判定为“黄花白及及片”。 3.2 HPLC辨识(M，法)结果 对134批4种饮片样本各随机抽取3个(白及饮片编号为4、9、27；天麻饮片编号为46、65、70；玉竹饮片编号为78、97、102；黄花白及饮片编号为109、114、131)为代表性样本建立HPLC图，见图1。从图1可以明显看到白及与天麻、玉竹、黄花白及饮片指纹图谱不同程度的差异；以45批白及饮片和对照药材为代表性样本，建立白及指纹图谱，45批白及的指纹图谱相似度均高于0.90(均值0.931)，30批天麻指纹图谱相似 图1 3批白及、3批天麻、3批玉竹、3批黄花白及的 HPLC图 度为0.2-0.34(均值0.263，P<0.01)，30批玉竹的指纹图谱相似度为0.1-0.2(均值0.134，P<0.01)，黄花白及的指纹图谱相似度为0.7-0.88(均值0.822，P<0.05)，因此根据指纹图谱的相似度对比确定判别结果，M，法的二分类和四分类判别结果与M法一致。 3.3 二分类辨识模型及交互验证结果 3.3.1 PCA-DA辨识模型及交互验证结果 变量选择7个时PCA-DA模型性能达到最优，前7个主成分贡献百分比之和达99%以上，可解释原变量大部分信息，经留一法交互验证，除77号、78号这2个玉竹样本被误分为白及样本外，其余样本均被正确分类。模型主成分分分图见图2.45批白及饮片和89批非白及饮片存在重叠现象，说明大多数白及饮片与非白及饮片在这两个变量(味道)上较为相似，但该模型整体正判率达98.51%，因此，在此模型下基本可将白及饮片与非白及饮片进行区分。 3.3.2 PLS-DA辨识模型及交互验证结果 潜变量个数数4时PLS-DA模型性能达到最优，4个潜变量可解释80%以上的自变量差异信息和30%左右的因变量差异信息，经留一法交互验证，134个样本均被正确分类。模模主成分得分图见图3，45批白及饮片和89批非白及饮片部分存在重叠现象，说明两类饮片在这两个变量(味道)上存在味道相似情况，但该模型的正判率高达100.00%，因此，在此模型下可完全将白及饮片与非白及饮片进行区分。 3.4 四分类辨识模型及交互验证结果 3.4.1 PCA-DA判别模型及交互验证结果 PCA-DA最优辨识模型参数为变量选择7个；前7个主成分贡献百分比比和达99%以上，可解释原变量大部分信息，经留一法交互验证，45批白及、30批天麻、30批玉竹、29批黄花白及均被正确分为1、2、3、4 图22PCA-DA模型主成分得分图 图3 PLS-DA模型主成分得分图 图4 PCA-DA模型主成分得分图 类，且不存在未分类样本。模型主成分得分图见图4，白及饮片与玉竹饮片、黄花白及饮片不存在重叠现象，天麻饮片与白及饮片重叠部分较多，说明白及饮 有4个未分类样本，分别为31号、77号、78号、84号样本。模型正判率为100.00%，模型主成分得分图见图5，除白及饮片和天麻饮片存在重叠现象外，其余饮片均不存在交叉重叠现象，说明白及饮片和天麻饮片在这两个变量(味道)上较为相似，但该模型正判率为100.00%，因此，在此模型下可完全将四类饮片进行区分。 3.5 电子舌各味觉传感器(变量)的模型贡献结果 电子舌共采集8种味觉信息，即酸味、苦味、涩味、苦味回味、涩味回味、鲜味、丰富性、咸味的味觉数据，分别标记为1、2、3、4、5、6、7、8号味觉变量，只考虑变量本身、不考虑分类结果模型情况下，8个变量所携带变异信息 Wilk’s lambda柱状图见图6， Wilk's lambda 越小则表示变量携带变异信息越强，因此二分类辨识模型和四分类辨识模型的8号、3号、4号、5号变量的贡献度较大，且均呈正相关；7号变量的模型贡献度最小。将最优模型的变量优选过程各传感器的潜变量载荷图图6(b)、图6(d)与 Wilk’s lambda 柱状图图6(a)、6(c)结合，观察不同特征对于分类结果的贡献，可看到7号变量在原点附近，说明该特征属性波动在样本之间区别的贡献不大，其余7个变量分布较为分散， 图6 模型贡献度分析 注：a.二分类辨识模型 Wilk's lambda 柱状图；b.PLS-DA二分类识识模型变量载荷图；c.四分类辨识模型 Wilk's lambda 柱状图；d.PCA-DA四分类辨 ( 识模型变量栽荷图：+：传感器信息值与结果正相关；) ) ( 1536 [ Mod e r ni zation of T r a d i tional Ch i nese Me di cine a n d Ma te ria M e d ica-Wo r ld Sci e nce and Technology) ) 说明这7个变量均携带显著的变异信息。 4讨论 4.1 模型构建结果及电子舌(M，法)响应分析 除二分类的PCA-DA模型正判率为98.51%外，其余三种模型正判率均高达100%，表明电子舌技术对白及和其相似饮片的分类辨识具有极高的潜力。虽然4种模型的主成分得分图的不同饮片之间存在部分重叠现象，样品间在主成分1和2的变量(饮片味道)上具有一定程度的相似性，但它仅为饮片分类结果贡献大部分信息的二维图，而最终饮片分类结果需靠三维或多维图来完成。另外，模型变量载荷图亦是这个道理，电子舌传感器的分类结果中对第一潜变量贡献较大的分别别5、4、3、2这4个变量，分别为涩味回味、苦味回味、涩味、苦味传感器，其中涩味回味是区分4种饮片的最关键味道，苦味回味、涩味、苦味虽不是最关键味道但对饮片分类结果也有贡献。尽管有关键变量(传感器)，但分类模型不是仅仅靠某一个变量，最终还是要靠综合判定，只是某些变量贡献度更大而已。变量8虽然 wilk’s lambda 较大，但并非影响分类的最关键变量。 4.2分分错类与未分类样本分析 77号、78号样本在二分类的PCA-DA模型构建中被错误分为白及饮片，在四分类的PLS-DA模型构建中未被分类，但基于M，法与M，法均被确认为玉竹饮片，因此推测可能为样本的来源产地不同、保存时间较长以及储藏环境差异使之味道发生了改变。除77号、78号样本外，31号、84号样本也在四分类的PLS-DA模型构建中未被分类，这可能与模型本身的机理 ( 参考文献 ) ( 1 夏涛， 王 昌权，陈浩，等.白及有效成分Milit a rine在肝微粒体中的体 外代谢途径及其 酶 促动力学特征.中国药房，20 1 9.30(10)：13 1 6 - 132 0 . ) ( 2 李明华，程显隆、李 宁 新 ， 等.白及的质量问题及真伪鉴别方法. 中 国药事，2 0 18，32(11)：1490-1 4 99. ) ( 3 张曼，韩亭亭，胡春芳 ， 等.白及产业现状及可持续发展策略.中草 药，2019.50(20)：5103-5108. ) ( 4 萌.白及与其混淆品、伪品的生药学对比研究. 成 都：成都中医药大学硕士研究生学位论文，2012. ) ( 5 翟萌.马逾英 ， 郑光雅 ， 等.市售白及与 三 种混伪品的对比鉴别.成 都中医药大学学报 ， 2012.35(3) ： 53-56. ) 有关；相较于PLS-DA模型，PCA-DA模型并未出现未分类样本，更适用于饮片的四分类辨识。 4.3 电子舌的应用展望 本研究所用的电子舌技术是通过传感器采集样品味觉信息从而实现样品的分类辨识，且所建模型正判率较高，说明此技术较好的适用于白及及近似饮片的分类辨识。然而，中药领域广泛，饮片种类繁多，辨识复杂，在其嗅觉、味觉及视觉特征上均有所体现，但对于那些味觉特征不明显的饮片，较难通过电子舌技术进行分类。目前，发展智能感官融合技术2729是未来进行中药饮片分类的方向之一，可结合同类不同型的电子舌技术或其他电子感官技术如电子眼2、电子鼻428等，构建二源或多源智能感官识模型型，辨识结果势必会更加可靠。 5结论 二分类辨识模型的正判率PCA-DA味觉检测指标：TS-5000Z 型电子舌（日 本 INSENT公司）分析结果：二分类辨识模型的正判率 PCA-DA < PLS-DA，四分类辨识模型的正判率 PCA-DA = PLS-DA（PLS-DA 模型中有未分类样本）， 因此二分类辨识以 PLS-DA 为最终辨识模型、四分类辨识以 PCA-DA 为最终辨识模型。综合比较， 电子舌辨识较药典与地方标准辨识（M 1法）、HPLC 辨识（M 2 法）的检测时间显著缩短，二分类与四分类辨识模型正判率均可达 100%， 与 M 1 法和M 2 的辨识结果一致。电子舌各味觉传感器（变量）的模型贡献结果电子舌共采集 8种味觉信息，即酸味、苦味、涩味、苦味回味、涩味回味、鲜味、丰富性、咸味的味觉数据，分别标记为 1、2、3、4、5、6、7、8 号味觉变量。总体而言， 该技术能够实现对白及及其相似饮片分类的相对快速、准确地辨识， 为中药饮片的质量评价提供了新思路、新技术， 同时为构建中药饮片质量快速辨识智能专家系统奠定了基础。文献来源：河南中医药大学药学院