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跨膜糖蛋白Trop2与许多上皮癌有关。它不仅在促进胎儿肺生长方面发挥作用,还参与肿瘤发生、恶性转化和肿瘤播散。然而,Trop2在分子水平上的详细分布仍然未知。本文使用直接随机光学重建显微镜揭示了Trop2在培养和原代肺癌细胞和正常细胞膜上的空间组织。所有类型的癌细胞都比正常细胞呈现更多的Trop2定位。通过SR-Teseller聚类分析,我们发现Trop2以簇的形式存在于所有膜上;然而,癌细胞产生的簇比正常细胞更多,由更多的分子组成。本研究结果揭示了膜Trop2的异质分布,突出了肺癌细胞与正常细胞之间膜Trop2聚集特征的显著差异,为进一步研究Trop2聚集在肺癌中的机制和功能奠定了基础。研究结果(节选)1.Trop2在不同培养细胞上的高分辨率成像NSCLC主要包含三种类型,每种类型中选择一种细胞作为代表:A549代表ADC,sk-MES-1代表SqCC,H460代表LCC。由于NSCLC是异质性原发性支气管上皮肿瘤,我们选择HBE细胞作为对照组。TIRF图像显示Trop2散射在所有细胞膜上,其中一些形成荧光斑点,但无法清晰区分(图1a-d)。然而,重建的dSTORM图像显著提高了分辨率(图1e-h)。我们观察到HBE细胞膜上只有少数Trop2,而在三种类型的NSCLC细胞膜上则有大量Trop2。此外,放大后的图片详细显示了Trop2的异质分布(图1i-l)。图 1.Trop2在不同细胞系上的dSTORM成像四种细胞膜上Trop2的TIRF图像:(a)HBE,(b)A549,(c)H460和(d)SK-MES-1。(e–h)在这四个细胞膜上相应的重建的Trop2的dSTORM图像。(i-l)白色框框显示的 Trop2 dSTORM 图像的放大视图。比例尺:5 μm(e–h) 和 1 μm(i–l)2.通过SR-Tesseler方法对Trop2进行聚类分析除了获得Trop2的高分辨率图像外,使用合适的方法来定量分析蛋白质的空间分布同样重要。到目前为止,各种分析方法已被应用于超分辨率成像数据,例如Ripley's K函数,DBSCAN (基于密度的噪声空间聚类分析),H-SET [36](分层单发射器假设检验)和FOCAL (用于定位的快速优化聚类算法)。每种算法都有自己的优势和应用范围。在这里,我们使用了一种新的图形处理方法SR-Tesseler,它可以精确地分割定位并提取集群的信息。图 2. SR-Tesseler分析示意图(a)在HBE细胞膜上重建的Trop2的dSTORM图像。细胞膜用红线圈出“ROI”。(b) 闪烁校正后的 dSTORM 图像。(c) 由许多多边形组成的沃罗诺伊图。(d) 对每个多边形的局部化密度进行阈值化提取的蓝色区域(e) 提取的簇(绿色)的定位密度高于对象的平均密度。(f-h) 图(c–e)框在中的多边形、对象和聚类的放大图像。比例尺:4 μm(a–e) 和 300 nm(f–h)。3.Trop2 在原发性肺癌细胞上的显着簇分布为了进一步探索和验证Trop2簇在原代细胞上的分布特征,我们选择人原发性肺腺癌细胞作为NSCLC的代表,配对原代正常肺上皮细胞作为对照。与培养细胞一致,dSTORM图像显示Trop2过度表达并在肺癌细胞上形成大簇,而在正常肺细胞上存在相对较少的蛋白质和小簇(图3a-f)。统计数据表明,Trop2在癌细胞上的定位密度几乎是正常细胞的两倍(图3g)。SR-Tesseler分析还证明了聚类特征的显著差异。癌细胞上的簇面积和簇数都远大于正常细胞上的簇面积和簇数(图3h-i)。此外,癌细胞具有更密集的簇,由200多个定位组成,而对于不超过100个定位的小簇,正常细胞占更大的比例(图3j)。结果与从A549和HBE细胞获得的结果一致。这些发现证实了Trop2与肺癌的肿瘤发生有关,其过表达和聚集分布可能使其成为肺癌诊断的良好标志物。图 3.原发性肺腺癌细胞和正常细胞上的 Trop2 分布通过 dSTORM 成像显示(甲至乙)(a)原发性肺癌细胞和(b)正常肺细胞上的Trop2的TIRF图像。(c–d)同一细胞膜上的相应dSTORM图像。(e–f)图(c–d)白色框框的 dSTORM 图像的放大视图。比例尺:5 μm(c–d) 和 1 μm(e–f)。(g)Trop2在这两种细胞上的定位密度。(h) 不同细胞膜上的团簇标准化。(i) 每平方微米的团簇数(j) 团簇百分比。所有结果均来自五个独立实验中的十个细胞样品。采用双尾不配对t检验处理统计学意义。*P < 0.05,**P < 0.01,****P < 0.0001,ns 表示不显著。结论综上所述,利用dSTORM观察了Trop2在NSCLC细胞和正常细胞(培养细胞和原代细胞)膜上的分布格局,并利用SR-Tesseler分析了其聚集特征。我们发现Trop2在癌细胞上的表达和聚集水平高于正常细胞,这表明Trop2在癌细胞中的过表达和聚集的共同特征,这将有助于早期癌症诊断。尽管Trop2簇存在于所有肺癌细胞中,但值得注意的是,不同种类的癌细胞之间的团簇性质不同。例如,A549和H460细胞具有相对更多的簇,而SK-MES-1细胞具有与HBE细胞相似的簇数。我们的研究结果为癌症相关蛋白(如Trop2)聚集的分子机制提供了新的见解,并有利于开发针对癌症中Trop2的新药。文献等详见【阅读原文】↓↓↓在本研究中,研究者主要借助STORM超分辨率显微镜来研究Trop2对非小细胞肺癌和正常细胞膜的变化,目前在国内,随机光学重建显微镜STORM已成功实现商用,有需要STORM成像技术进行实验研究的专家老师们,请文末填写问卷,即可预约获得 iSTORM 超高分辨率显微成像系统试拍服务~力显智能现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM,成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破,使得在20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及大分子复合物结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实,从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。
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