AccuSizer 颗粒计数器用于蛋白质配方筛选和 USP 测试

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1.  引言动态光散射 (DLS) 是检测蛋白质粒径的标准工具，但该方法不提供浓度信息。AccuSizer® 单粒子光学传感技术 (SPOS) 系统可用于检测聚集蛋白粒径和浓度，可测量150nm以上的聚集蛋白浓度。图 1 显示了单抗产品热应激前后的 Nicomp® DLS 结果。加热后的结果（蓝色）显示了高分辨率的多峰结果，包括从~150 nm开始的较大的聚集峰。AccuSizer 无法检测到 10 nm 的颗粒，但可以提供 >150 nm聚集蛋白的定量数据。在这项研究中，AccuSizer FX Nano 用于研究各种配方稳定化学物质如何影响NIST标准蛋白质的最终聚集状态。AccuSizer FX Nano也可用于 USP<787>亚可见颗粒物测试1。2.  材料使用的蛋白质是 NIST 标准物质 8671，批号 14HB-D002，NIST mAb，人源 IgG1k 单抗2。在Nicomp动态光散射(DLS)系统上，使用35mw激光二极管源，APD检测器测量蛋白质的初次粒径。在配备两个传感器的AccuSizer FX Nano SIS系统上测量蛋白质聚集体:LE-400; 0.5 – 400 μm 和 FX Nano; 0.15 – 10 μm.SIS进样器提供精确的样品体积，最小进样量低至100 μL且可回收。 iFormulate3（图 2）板预装了配方，由 DoE 设计用于合理的配方开发，用于测试配方的聚集水平。评估了蛋白配方的四个主要影响因素；pH、离子强度、缓冲液和稳定剂浓度。使用的 iFormulate 板测试了以下影响因素： • pH：5 – 7.6 • 离子强度：0 – 200 mM NaCl • 海藻糖稳定剂：0 – 10 % • 缓冲液浓度：10 – 50 mM3.  方法将 NIST mAb 解冻并稀释至 1 mg/mL，将 160 μL 过滤的去离子水添加到 iFormulate 板的每个孔中。每孔加入40 μL NIST mAb。将培养皿置于60°C(刚好低于蛋白质熔点)的烤箱中24小时。使用 AccuSizer 颗粒计数器分析每个孔。将>0.15 μm(总)和>0.53 μm的颗粒计数数据提交给iformula，由iformula进行数据分析和稳定性建模。4.  结果数据使用帕累托分析方法处理，帕累托分析方法在多影响因素下十分有效。帕累托分析给出了影响因素排名和影响因素之间的相互作用。图 3 和图 4 分别显示了 >0.15 μm 和 >0.53 μm 的帕累托分析。颜色表示配方变量对增加的颗粒计数的相对重要性，蓝色 = 重要，灰色 = 临界，红色 = 不太重要。下面的结果显示了不同条件下聚集效应的 3D 响应曲面图。这种设计空间提供了通过检测在两个粒径范围内颗粒浓度的方法，以此来确定可最大限度减少聚集配方。图 5 和图 6 显示了在保持缓冲液和 NaCl 浓度不变的情况下，改变 pH 值和稳定剂（海藻糖）的结果。图5 pH值和稳定剂的影响>0.15μm图6 pH值和稳定剂的影响>0.53μm图 7 和图 8 显示了不同 NaCl 和稳定剂（海藻糖）浓度的结果，同时保持缓冲液浓度稳定且 pH 值从 5.91 略微变化到 6.3。图7 NaCl和稳定剂的作用>0.15μm图8 NaCl和稳定剂的作用>0.53μm然后对这些结果以及此处未显示的其他结果进行整理，图9和图10显示了最小粒子数优化图。图9 颗粒最小化图>0.15μm图10 颗粒最小化图>0.53μm5.    结论此处显示的结果表明，可减少颗粒计数并因此减少蛋白质聚集的最佳化学制剂为： pH = 6.1 – 6.3 NaCl = 40 – 70 mM 海藻糖 = 7 – 8% 缓冲液 = 50 mM AccuSizer也可用于在≥10和25μm的条件下进行USP＜787＞测试，并可使用A2000 USP微孔板分析仪实现自动化。参考资料[1] USP<787>, Subvisible Particulate Matter in Therapeutic Protein Injuctions, see usp.org [2] NIST reference material 8671, Lot 14HB-D-002, NIST mAb[3] iformulate[4] AccuSizer A2000MPAPareto Effects for Total AccuSizer 颗粒计数器用于蛋白质配方筛选和 USP<787> 测试 AccuSizer @自动颗粒计数分析仪可用于蛋白质配方优化，使最大程度地减少蛋白质聚集并 执行 USP <787> 亚可见颗粒物质测试。 用于蛋白质配方优化的 AccuSizer颗粒计数器，，能最大程度地减少蛋白质聚集，并执行 USP<787>不溶性微粒检测。 简介 动态光散射 (DLS) 是检测蛋白质粒径的标准工具，但该方法不提供浓度信息。AccuSizer @单粒子光学传感技术 (SPOS) 系统可用于检测聚集蛋白粒径和浓度，浓度可测量 150nm 以 上的聚集蛋白。图1显示了单抗产品热应激前后的 Nicomp@ DLS 结果。加热后的结果(蓝 色)显示了高分辨率的多峰结果，包括从~150 nm 开始的较大的聚集峰。AccuSizer 无法检 测到 10nm 的颗粒，但可以提供 >150 nm 聚集蛋白的定量数据。在这项研究中，AccuSizer FX Nano 用于研究各种配方稳定化学物质如何影响 NIST 标准蛋白质的最终聚集状态。AccuSizer FX Nano 也可用于 USP <787> 亚可见颗粒物测试1。 Figure 1. Nicomp DLS results before and after heat stress 图1.加热前后的 Nicomp DLS 结果 材料 使用的蛋白质是 NIST标准物质 8671，批号 14HB-D002， NIST mAb， 人源 IgG1k 单抗。在 Nicomp 动态光散射(DLS)系统上，使用35mw激光二极管源， APD 检测器测量蛋白质的 初次粒径。在配备两个传感器的 AccuSizer FX Nano SIS 系统上测量蛋白质聚集体：LE-400；0.5-400 um 和 FX Nano； 0.15 -10 um.SIS 进样器提供精确的样品体积，最小进样量低至 100 uL 且可回收。 iFormulate3(图2)板预装了配方，由 DoE 设计用于合理的配方开发，用于测试配方的聚 集水平。评估了蛋白配方的四个主要影响因素； pH、离子强度、缓冲液和稳定剂浓度。 Figure 2. iFormulate plate 使用的 iFormulate 板测试了以下影响因素： ·pH：5-7.6 ·离子强度：0-200 mM NaCl ·海藻糖稳定剂：0-10% ·缓冲液浓度：10-50mM 方法 将 NIST mAb 解冻并稀释至 1mg/mL，将 160 pL 过滤的去离子水添加到 iFormulate 板的 每个孔中。每孔加入 40 pL NIST mAb。 将培养皿置于60℃(刚好低于蛋白质熔点)的烤箱中 24 小时 。使用 AccuSizer 颗粒计数器分析每个孔 。 将>0.15 um(总)和>0.53 um 的颗粒计数 数据提交给 iformula， 由 iformula 进行数据分析和稳定性建模。 结果 数据使用帕累托分析方法处理，帕累托分析方法在多影响因素下十分有效。帕累托分析给出 了影响因素排名和影响因素之间的相互作用。图3和图4分别显示了 >0.15 um 和 >0.53um 的帕累托分析。颜色表示配方变量对增加的颗粒计数的相对重要性，蓝色=重要，灰 色=临界，红色=不太重要。 Figure 3. Pareto effects for >0.15 pm (Total) Pareto Effects for MT 0.53 Micron 2Buf f e r _Co ne^2 10 Na C l*T r e h a lose Buff e r Co n c 4Treh a l ose 9 Buffer Con e *Tre h alose p H*Tre h a l ose p H^2 91pH 5p H *Buffer _Co n e 14T Tre h a l o se ^2 8 Bu f f e r _Co n e *NaC l 13 N a CI ^26p H *N a Cl N aC l Figure 4. Pareto effects for>0.53 um 下面的结果显示了不同条件下聚集效应的3D 响应曲面图。这种设计空间提供了通过检测 在两个粒径范围内颗粒浓度的方法，以此来确定可最大限度减少聚集配方。图5和图6显 示了在保持缓冲液和 NaCl 浓度不变的情况下，改变 pH 值和稳定剂(海藻糖)的结果。 Figure 5. E f fec t of pH and stabilizer>0.15 pm Figure 6. Effec t of pH and stabilizer>0.53 um 图7和图8显示了不同 NaC l 和稳定剂(海藻糖)浓度的结果，同时保持缓冲液浓度稳定 且 pH 值从5.91略微变化到6.3。 F i gure 7. Effect of NaCl and stabilizer>0.15 pm Figure 8. Effect of NaCl and stabi l izer>0.53 pm 然后对这些结果以及此处未显示的其他结果进行整理，图9和图10显示了最小粒子数优化 图。 T o t a lx10^6 Fi g ur e 9. Pa r t i c l e m i n imization pl ot >0.15 p m F ig u r e 10. P a r t icle mi n i m iz a tion plo t >0.53 p m 结论 此处显示的结果表明，可最大程度减少颗粒计数并因此减少蛋白质聚集的最佳化学制剂为： pH=6.1-6.3 NaCl=40-70mM 海藻糖=7-8% 缓冲液=50mM AccuSizer 也可用于在≥10和 25um 的条件下进行 USP<787>测试， 并可使用A2000 USP 微 孔板分析仪实现自动化。