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芦苇及其青贮饲料中蛋白质、脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的检测

检测样品 饲料

检测项目 营养成分

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复合菌制剂对芦苇青贮饲料发酵品质和瘤胃发酵特性的影响

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复合菌制剂对芦苇青贮饲料发酵品质和瘤胃发酵特性的影响动物营养学报2023,35(4):2443⁃2454Chinese Journal of Animal Nutritiondoi:10.12418/CJAN2023.229 动 物 营 养 学 报444235卷 复合菌制剂对芦苇青贮饲料发酵品质和 瘤胃发酵特性的影响 黄 棋 1,2 汪水平 1∗ 黄桥深 1 刘 勇 1 杨 鑫 1张永康 1 刘 勇 2 李茂春 3∗ (1.西南大学动物科学技术学院 ,草食动物科学重庆市重点实验室 ,重庆 402460;2.中国科学院亚热带农业生态研究所 ,长沙 410125;3.岳阳市农业科学研究院畜牧兽医研究所 ,岳阳 414000) 摘 要 :本研究旨在探索复合菌制剂 (同质乳酸杆菌 /异质乳酸杆菌 、枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌 及其配伍 )对芦苇青贮饲料营养成分 、发酵品质和瘤胃发酵特性的影响 。以洞庭湖区生长期的 芦苇为青贮原料 ,设 5个组 ,分别为空白组 (CK 组 )、乳酸菌组 (LA 组 ,添加植物乳杆菌 、戊糖片 球菌和布氏乳杆菌 )、乳酸菌 +枯草芽孢杆菌组 (LA+BS 组 )、乳酸菌 +黑曲霉菌组 (LA+AN 组 )和乳酸菌 +枯草芽孢杆菌 +黑曲霉菌组 (LA+BS+AN 组 ),每组 3个重复 。乳酸菌添加量均为 1.5×108 CFU/kg 青贮原料 ,黑曲霉菌和枯草芽孢杆菌添加量为 1.0×108 CFU/kg 青贮原料 (均以 青贮原料鲜重为基础 )。青贮 60 d 后 ,测定芦苇青贮饲料的营养成分和发酵品质 ,并通过体外发 酵试验和体内降解试验评估其瘤胃发酵特性 。结果表明 :1)LA 组 、LA+BS 组和 LA+AN 组干 物质和粗灰分含量显著低于 CK 组 (P <0.05),LA+BS 组 、LA+AN 组和 LA+BS+AN 组粗蛋白质 含量显著高于 CK 组和 LA 组 (P <0.05)。 2)各组青贮饲料感官评定得分均在 60~70分 ,评级均 为良好 ;LA+BS 组和 LA+AN 组发酵品质综合得分较高 ,其中 ,LA+AN 组氨态氮 /总氮值 、乙酸 含量和乙酸 /总酸值较 CK 组显著降低 (P <0.05),乳酸含量和乳酸 /总酸值较 CK 组显著提高 (P <0.05)。 3)LA+AN 组体外发酵干物质消失率和总产气量显著高于其他组 (P <0.05),发酵 液中挥发性脂肪酸含量等体外发酵参数得到改善 。 4)LA+AN 组和 LA+BS+AN 组 8、24和 48 h 的瘤胃体内发酵干物质降解率显著高于其他 3组 (P <0.05)。综上所述 ,在本试验添加量下 ,乳 酸菌和黑曲霉菌联用对芦苇青贮品质以及瘤胃发酵特性改善效果最好 。 关键词 :芦苇 ;复合菌制剂 ;青贮 ;发酵品质 ;瘤胃发酵特性 中图分类号 :S816 文献标识码 :A 文章编号 :1006⁃267X (2023)04⁃2443⁃12 芦苇是多年生禾本科植物 ,具有十分重要的 生态和经济功能 [1]。芦苇主要生长于湖泊或沼泽 区域 ,分布区域辽阔 ,生物资源丰富 ,2017年 ,我国 芦苇年产量高达 300多万 t ,其中洞庭湖区芦苇产 量约占 1/3[2]。传统造纸行业以芦苇作为主要原 材料 ,近年来 ,芦苇造纸产业由于其污染问题被全 面关停 ,引发芦苇大面积弃收 ,造成资源严重浪 费 ,带来严峻的生态问题 ,导致芦苇产业发展陷入 困境 [3]。随着我国草食畜牧业规模不断扩大 ,苜 蓿 、燕麦草等优质饲草资源供应日趋紧张 ,合理利 用芦苇资源 ,将其作为一种非常规饲料资源进行 饲料化高效利用不仅可实现资源循环利用 ,减少 生态环境压力 ,还可扩大饲料资源库 ,缓解我国饲 料资源紧缺的现状 。 (2020NK2012) 作者简介 :黄 棋 (1999—),男 ,湖南郴州人 ,硕士研究生 ,动物营养与饲料科学专业 。 E⁃mail :workhq@163.com 青绿芦苇是优良饲草 ,具有较高的营养价值 及饲用价值 ,富含有机酸 、多糖类和黄酮类化合物 等活性物质 ,具有免疫调节 、护肝 、抑菌 、抗衰老和 抗氧化等多种生理活性 ,在提高生长性能和免疫 性能方面发挥着重要作用 [4-7]。青贮可以在保存 芦苇高消化性营养物质的基础上 ,延长保存时间 ,提高消化率和适口性 。研究发现 ,不同生长阶段 的芦苇均可进行青贮 ,且最适时期为抽穗期 [8]。已有研究表明 ,青贮添加剂的开发和利用在高品 质青贮饲料生产和牧草产业发展中具有重要的作 用 ,能显著提高饲料的性能和营养价值 [9-10]。植 物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum )、戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus )和布氏乳杆菌 (Lactoba⁃cillus buchneri )是目前常用于提高青贮发酵品质 的乳酸杆菌 ,可以增加青贮初期乳酸菌数量 ,促进 乳酸发酵 ,以促进发酵体系前期快速产酸形成酸 性环境 ,抑制腐败霉菌的生长和营养素消耗 ,对青 贮发酵品质的保障十分重要 [11-13]。黑曲霉菌 (As⁃pergillus niger )具有裂解大分子有机物和难溶无机 物而便于吸收利用的效果 [14];枯草芽孢杆菌 (Ba⁃cillus subtilis )可有效分解粗纤维等抗营养因子 ,释 放营养物质 ,促进可消化营养素的消化吸收 [15]。不过 ,因单一菌制剂功能单一性和局限性 ,复合菌 制剂功能开发成为当前青贮菌制剂领域研究的热 点问题 。 目前 ,芦苇青贮技术相对不成熟 ,相关研究较 少 ,青贮后的品质和适口性较差 ,营养损失严重 。且菌制剂调控芦苇青贮饲料的品质的研究尚不多 见 。因此 ,本研究选择复合菌制剂作为青贮添加 剂 ,探究不同菌制剂搭配对青贮芦苇营养成分和 发酵品质的影响 ,为改善芦苇青贮品质提供理论 支撑 ,促进芦苇饲料化进程 。 1 材料与方法 1.1 试验材料 本试验所用材料为湖南省岳阳市洞庭湖区的 生长期全株芦苇 ,于 2021年 5月 15日刈割后室温 放置 1.5 h ,晾干表面水分后立即用粉碎机粉碎 ,粉 碎长度为 2~3 cm 。取 200 g 芦苇原料在 65 ℃烘 箱中 ,烘干至恒重 ,粉碎后过 40目筛 ,密封保存备 用待测常规营养成分 ,其余立即制作青贮 。芦苇 营养成分见表 1。 表 1 芦苇营养成分 (干物质基础 ) Table 1 Nutrition composition of Phragmites australis (DM basis ) g/kg 项目Items 含量 Content 干物质 DM 283.76 粗蛋白质 CP 87.18 可溶性碳水化合物 WSC 21.99 中性洗涤纤维 NDF 786.05 酸性洗涤纤维 ADF 461.87 粗脂肪 EE 62.26 粗灰分 Ash 106.64 总能 GE/(MJ/kg) 16.41 1.2 试验设计 采用单因素试验设计 ,试验共设 5个组 ,分别 为空白组 (CK 组 )、乳酸菌组 (LA 组 ,添加植物乳 杆菌 、戊糖片球菌和布氏乳杆菌 )、乳酸菌 +枯草芽 孢杆菌组 (LA+BS 组 )、乳酸菌 +黑曲霉菌组 (LA+AN 组 )、乳酸菌 +枯草芽孢杆菌 +黑曲霉菌组 (LA+BS+AN 组 ),每组 3个重复 。每个重复称取 1 000 g 左右样品 ,加入对应菌制剂 [由威凯海思 (山东 )生物工程有限公司提供 ,活菌数均为 1.0×1010 CFU/kg ,植物乳杆菌 、戊糖片球菌和布氏乳杆 菌添加量均为 1.5×108 CFU/kg 青贮原料 ,枯草芽 孢杆菌和黑曲霉菌添加量为 1.0×108CFU/kg 青贮 原料 (均以青贮原料鲜重为基础 )]。调制好后装 入聚丙乙烯袋中 (40 cm×60 cm ),抽真空后密封 ,置于室温 (25~30 ℃)避光保存 ,贮藏 60 d 后测定 营养成分和发酵品质 ,并用体外发酵试验和体内 降解试验评价青贮后 5组青贮芦苇的瘤胃发酵 特性 。 1.3 指标测定 1.3.1 原料和青贮饲料常规营养成分含量 取 200 g 芦苇原料和青贮饲料 ,在 65 ℃烘箱 中烘干至恒重 ,粉碎后过 40目筛 ,密封保存备用 。依据国标 [16]的方法测定营养成分含量 ,具体包括 :样品在 105 ℃烘箱中烘干 ,取出在干燥器中冷却 30 min 后测定干物质 (dry matter ,DM )含量 ;采用 凯氏定氮法测定粗蛋白质 ( crude protein ,CP )和总 氮 ( total nitrogen ,TN )含量 ;采用范式洗涤纤维法 测定酸性洗涤纤维 ( acid detergent fiber ,ADF )和中 性洗涤纤维 (neutral detergent fiber ,NDF )含量 ;采 用索氏提取法测定粗脂肪 ( ether extract ,EE )含量 ;采用灼烧恒质量法测定粗灰分 (Ash )含量 ;采用蒽 酮 -硫酸比色法测定可溶性碳水化合物 (water⁃sol⁃uble carbohydrate ,WSC )含量 ;采用精密全自动量 热仪 (5E-C5508,Kaiyuan Instrument ,中国 )测定 总能 (gross energy ,GE )。 1.3.2 青贮发酵品质 青贮 60 d 后 ,开袋取出青贮饲料混合均匀后 ,准确称取 50 g 青贮饲料放入 500 mL 锥形瓶中 ,加 450 mL 无菌水后封口 ,振荡混匀后于 4 ℃冰箱中 浸提 24 h ,用涤纶布和定量滤纸过滤获得浸提液 。使用 pH 计测定 pH ,使用高效液相色谱仪 (Agilent-1290,美国 )测定乳酸 ( lactic acid ,LA )含 量 ,使用高效气相色谱仪 (Agilent-7890A ,美国 )测定乙酸 ( aceticacid ,AA )、丙酸 (propionicacid ,PA )和丁酸 (butyricacid ,BA )含量 ,使用苯酚 -次 氯酸钠比色法测定氨态氮 (NH3⁃N )含量 。参照刘 建新等 [17]的评分标准进行感官评定和发酵品质评 价 ,根据感官评定得分将青贮饲料划分为 4个等 级 ,分别为低劣 (0~25分 )、一般 (26~50分 )、良 好 (51~75分 )和优质 (76~100分 );根据所测青 贮饲料中的 NH3⁃N 、AA 、PA 和 BA 含量对发酵品 质评价 ,将有机酸得分除以 2,并加上 NH3⁃N 得 分 ,即为综合得分 ,满分 100分 。将青贮饲料划分 为 5个等级 ,分别为极差 (0~20分 )、差 (21~40分 )、可 (41 ~ 60分 )、良 (61 ~ 80分 )和优 (>80分 )。 1.3.3 体外发酵试验 称取 1.2 g 底物于 135 mL 厌氧发酵瓶中 。晨 饲前采集瘤胃液 ,装入保温瓶带回实验室 ,6层纱 布过滤后 ,量取 600 mL 滤液迅速加入提前准备好 的 2 400 mL 人工瘤胃缓冲液中 (39.5 ℃水浴 ,瘤 胃液与人工瘤胃营养液体积比为 1∶4),人工瘤胃 缓冲液参照 Menke 等 [18]的方法进行配制 。将配 好的缓冲液倒入其中 ,倒入发酵瓶中 ,每个发酵瓶 60 mL ,共计 33个发酵瓶 (每组 6个重复 ,3个空 白 ),期间不断通入二氧化碳 (CO2),保证厌氧条 件 ,然后用橡胶塞和铝制盖密封发酵瓶 ,置于 39 ℃恒温气浴摇床中 ,转速保持为 125 r /min ,用采血针 将气袋和发酵瓶连接好 ,开始发酵 。分别于发酵 过程中 0、2、4、6、8、10、12、24、36、48和 72 h 测量 发酵瓶中的产气值 ,并用空白值进行校对 。 72 h 后终止发酵 ,采集固体和液体样品进行测定 。 用 pH 计 [Starter-300,奥豪斯仪器 (上海 )有 限公司 ]测定每个发酵瓶中发酵液的 pH 。然后将 发酵瓶充分摇匀 ,取 2 mL 发酵液 ,12 000 r /min 、4 ℃下离心 10 min ,取 1.35 mL 上清液 ,加入 0.15 mL 25%偏磷酸固定 ,静置 15 min 后 ,-20 ℃保存 。样品在常温条件下解冻 ,然后 12 000 r /min 、4 ℃条件下离心 10 min ,取 0.6 mL 上清液装于测定瓶中 ,在气相色谱仪 (Agilent-7890A ,美国 )测定挥发性脂肪酸 (volatilefatty acids ,VFA )组分 [19]。同样取偏磷酸处理后的样品 参照 Weatherburn [20]的方法测定 NH3⁃N 含量 。最 后 ,剩余发酵液用 0.441 mm 的尼龙纱布过滤 ,置 于 105 ℃烘箱中烘干至恒重 。根据底物重量和烘 干之后的发酵底物重量 ,结合取样过程中发酵液 体积的变化 ,参考 Zhang 等 [21]描述的方法计算 DM 消失率 。 应用非线性软件程序 NLREG Version 5.4,按 照 Wang 等 [22]的模型对体外模拟瘤胃发酵产气曲 线进行拟合 ,并计算起始底物降解速率 (FRD0, / h )。模型及相关参数的计算公式如下 : 式中 :V 为 t 时间点底物累积产气量 (mL/g );FDR 0为 t =0时的底物降解速率 ;Vf 为理论最大产 气量 (mL/g ); k 为产气速率 ( / h );b 为曲线形状 指标 。 根据 Wang 等 [22]描述的公式 ,计算 VFA 产氢 量 (net hydrogen produce per VFA ,RNH2,‰),计算 公式如下 : 分别为 ac bu ibu pr va iva VFA 乙酸 、丁酸 、异丁酸 、丙酸 、戊酸 、异戊酸及 VFA 含 量 (mmol/L )。 1.3.4 体内降解试验 选择 3头体重相近 、健康状况良好及安装永 久性瘤胃瘘管的呼伦贝尔羊 ,按照中国科学院亚 热带农业生态研究所试验羊场日常饲养管理方式 饲养 。称取 3 g (精确至 0.000 1 g )样品放入已知 袋重的尼龙袋 (8 cm×10 cm ,300目 ,48 μ m 孔径 )中 ,尼龙袋用绳子绑紧并绑在扎带上固定 。在晨 饲前将尼龙袋投入羊瘤胃中 ,每头瘘管羊每个时 间点设有 2个平行 、3个重复 (3头羊总计每个样 品每个时间点 6个尼龙袋 ),共设 5个时间点 ,分 别在投入 8、16、24、48和 72 h 时取出 ,立即用清水 洗去尼龙袋上的残渣 ,然后清洗尼龙袋至水澄清 为止 。将尼龙袋放入 65 ℃烘箱 48 h 至恒重 ,称取 尼龙袋及残渣的重量 ,并将尼龙袋中瘤胃未降解 的残渣收集于自封袋 ,取样品残渣测定 DM 含量 ,计算 DM 降解率 (dry matter degradationrate ,DMD )。 式中 :A 为待测饲料瘤胃 DMD (%);B 为待测 饲料 DM 质量 (g );C 为残留物中 DM 质量 (g )。 1.4 数据处理与分析 采用 Excel 2019对数据进行整理 ,采用 SPSS 26.0软件进行单因素方差分析 (one⁃way ANO⁃VA )和 Duncan 氏法多重比较检验 ,试验结果以 “平均值 ±标准误 (mean±SE )”表示 ,P <0.05表示 差异显著 。 2 结果与分析 2.1 复合菌制剂对芦苇青贮饲料常规营养成分的 影响 由表 2可知 ,添加不同复合菌制剂对芦苇青 贮饲料的 WSC 、NDF 、ADF 和 EE 含量无显著影响 (P >0.05)。 LA 组 、LA+BS 组 、LA+AN 组和 LA+BS+AN 组 DM 含量显著低于 CK 组 (P <0.05),而 CP 含量 (LA 组除外 )含量显著高于 CK 组 (P <0.05);LA 组 、LA+BS 组和 LA+AN 组 Ash 含量显 著低于 CK 组和 LA+BS+AN 组 (P <0.05)。 表 2 复合菌制剂对芦苇青贮饲料常规营养成分的影响 (干物质基础 ) Table 2 Effects of compound bacteria preparation on conventional nutrient composition of Phragmites australis silage (DM basis ) g/kg 项目 组别 Groups P值 Items CK LA LA+BS LA+AN LA+BS+AN P⁃value 干物质 DM 273.58±0.09a 258.16±0.44c 264.34±0.12b 259.42±0.59c 266.53±1.47b <0.001 粗蛋白质 CP 54.15±4.17b 51.86±0.37b 67.57±1.18a 75.62±2.79a 68.02±3.84a 0.009 可溶性碳水化合物 WSC 6.25±0.27 6.91±0.13 7.29±0.53 7.89±0.29 6.45±0.55 0.138 中性洗涤纤维 NDF 737.03±6.77 724.21±26.38 678.04±11.93 657.08±15.79 712.00±14.26 0.076 酸性洗涤纤维 ADF 259.96±7.18 240.08±13.98 225.06±12.20 245.34±13.32 263.99±11.69 0.277 粗脂肪 EE 70.46±4.73 47.56±3.27 46.25±3.47 46.18±2.00 43.97±8.61 0.055 粗灰分 Ash 109.74±0.16a 99.26±1.34b 89.64±0.63c 100.28±0.03b 107.68±1.72a <0.001 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著 (P <0.05),相同字母或无字母表示差异不显著 (P >0.05)。下表同 。 In the same row , values with different small letter superscripts mean significant difference (P >0.05), while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P >0.05) . The same as below. 2.2 复合菌制剂对芦苇青贮饲料发酵品质的影响 由表 3可知 ,LA+BS 组 pH 及 NH3⁃N 、乙酸 、丙酸和丁酸含量均为最低 ,显著低于其他各组 (LA+AN 组 NH3⁃N 含量除外 )(P <0.05),乳酸 /乙酸值显著高于其他各组 (P <0.05);LA+AN 组 NH3⁃N 含量显著低于 CK 组 (P <0.05),乳酸含量 显著高于除 LA 组外的其他各组 (P <0.05),而乙 酸含量显著低于 CK 组 、LA 组和 LA+BS+AN 组 (P <0.05);LA+BS+AN 组乳酸和乙酸含量显著低 于 CK 组 (P <0.05),pH 、丙酸和丁酸含量显著高于 CK 组 (P <0.05)。 由表 4和表 5可知 ,各组青贮饲料在色泽 、气 味 、结构和水分得分上均无显著差异 (P >0.05),且 均无霉变现象 ,分级均到良好级别 。 LA+BS 组 NH3⁃N /TN 、乙酸 /总酸和丁酸 /总酸值均显著低于 CK 组和 LA 组 (P <0.05),乳酸 /总酸值显著高于 其他各组 (P <0.05);LA+AN 组 NH3⁃N /TN 和乙 酸 /总酸值均显著低于 CK 组和 LA 组 (P <0.05),而乳酸 /总酸值显著高于 CK 组和 LA 组 (P <0.05)。 CK 组 、LA 组和 LA+BS+AN 组青贮饲料 达到可等级 ,其中 CK 组的综合得分最低 ,LA+BS 组和 LA+AN 组评级上均达到良等级 ,其中综合得 分最高为 LA+BS 组 ,达 70.5分 。 表 3 复合菌制剂对芦苇青贮饲料发酵品质的影响 Table 3 Effects of compound bacteria preparation on fermentation quality of Phragmites australis silage 项目 组别 Groups P值 Items CK LA LA+BS LA+AN LA+BS+AN P⁃value pH 3.99±0.01d 4.02±0.01c 3.94±0.00e 4.12±0.00a 4.04±0.01b <0.001 氨态氮 NH3 ⁃N /(g/kg) 0.89±0.02a 0.84±0.05ab 0.60±0.06c 0.70±0.06bc 0.80±0.02ab 0.037 乳酸 LA/(g/kg) 17.58±0.25bc 18.57±0.29ab 16.81±0.19cd 18.75±0.48a 16.37±0.10d 0.008 乙酸 AA/(g/kg) 33.48±0.07a 34.07±0.99a 20.12±0.06d 29.57±0.22c 31.36±0.19b <0.001 丙酸 PA/(g/kg) 3.23±0.01c 4.29±0.17a 1.72±0.01d 3.12±0.04c 3.96±0.02b <0.001 丁酸 BA/(g/kg) 10.93±0.05b 12.05±0.34a 6.54±0.02c 11.83±0.05a 12.05±0.06a <0.001 乳酸 /乙酸 LA/AA 5.25±0.06c 5.45±0.07c 8.35±0.07a 6.34±0.12b 5.22±0.06c <0.001 表 4 复合菌制剂对芦苇青贮饲料感官评定得分的影响 Table 4 Effects of compound bacteria preparation on sensory evaluation score of Phragmites australis silage 项目 组别 Groups P值 Items CK LA LA+BS LA+AN LA+BS+AN P⁃value 色泽得分 Color score 16.17±1.17 17.25±0.75 15.33±1.20 16.00±0.50 16.50±1.50 0.851 气味得分 Odor score 11.67±0.73 9.25±1.75 10.33±0.73 12.17±1.20 9.83±1.83 0.515 结构得分 Structure score 9.67±0.17 9.75±0.25 9.50±0.00 9.50±0.00 9.50±0.00 0.431 水分得分 Moisture score 17.00±0.29 17.25±0.25 16.17±0.44 17.17±0.44 17.00±0.29 0.313 pH得分 pH score 14.50±0.00b 13.50±0.00c 16.00±0.00a 9.00±0.00e 12.00±0.00d <0.001 总得分 Total score 69.00±1.76 67.00±1.00 67.33±1.17 63.83±2.03 64.83±0.60 0.170 青贮饲料分级 Silage grading 良好 良好 良好 良好 良好 表 5 复合菌制剂对芦苇青贮饲料发酵品质综合得分的影响 Table 5 Effects of compound bacteria preparation on fermentation quality comprehensive score of Phragmites australis silage 项目 组别 Groups P值 Items CK LA LA+BS LA+AN LA+BS+AN P⁃value 氨态氮 /总氮 含量 Content /% 10.35±1.02a 10.10±0.68ab 5.52±0.69c 5.84±0.72c 7.42±0.63bc 0.016 <0.001 <0.001 <0.001 NH3 ⁃N /TN 得分 Score 37 40 48 48 44 乳酸 /总酸 含量 Content /% 28.35±0.23cd 28.71±0.26c 38.67±0.19a 31.17±0.41b 27.38±0.23d LA/TA 得分 Score 5 5 10 6 4 乙酸 /总酸 含量 Content /% 54.01±0.21a 52.66±0.21b 46.30±0.14d 49.17±0.25c 52.46±0.19b AA/TA 得分 Score 8 8 11 10 8 丁酸 /总酸 含量 Content /% 17.64±0.02d 18.63±0.05c 15.03±0.06e 19.67±0.16b 20.16±0.04a BA/TA 得分 Score 22 20 24 20 18 综合得分 Total score 54.5 56.5 70.5 66.0 59.0 等级 Rank 可 可 良 良 可 2.3 复合菌制剂对芦苇青贮饲料体外发酵特性的 影响 由图 1可知 ,在芦苇青贮的过程中添加复合 菌制剂对青贮后底物体外发酵总产气量有明显影 响 ,发酵 0~6 h 时 ,LA+BS 组的总产气量高于其 他各组 ,随后的 8~72 h LA+AN 组总产气量均高 于其他各组 。由表 6可知 ,LA+AN 组 DM 消失 率 、72 h 总产气量和潜在最大产气量均显著高于 其他 4组 (P <0.05);LA+BS 组总产气速率显著低 于 CK 组 、LA+AN 组和 LA+BS+AN 组 (P <0.05), 但 FRD0显著高于 CK 组和 LA+AN 组 (P <0.05)。由表 7可知 ,LA+BS 组和 LA+AN 组体外发酵 pH 显著高于其他 3组 (P <0.05),LA 组 pH 显著低于 其他 4组 (P <0.05);与 CK 组和 LA 组相比 ,LA+BS 组和 LA+AN 组 NH3⁃N 和总挥发性脂肪酸含 量 、乙酸 /丙酸值和 RNH2显著降低 (P <0.05);与 CK 组相比 ,其他各组丙酸含量显著提高 (P <0.05),丁酸 、异丁酸 、戊酸和异戊酸含量显著降低 (P <0.05),其中 LA+AN 组降低效果最显著 ,显著 低于其他 4组 (P <0.05);各组间乙酸含量无显著 差异 (P >0.05)。 表 6 复合菌制剂对芦苇青贮饲料体外发酵底物降解和产气参数的影响 Table 6 Effects of compound bacteria preparation on substrate degradation and gas production parameters of Phragmites australis silage in in vitro fermentation 项目 组别 Groups P值 Items CK LA LA+BS LA+AN LA+BS+AN P⁃value DM消失率 DM disappearance rate /(g/kg) 412.31±15.72b 405.81±1.58b 389.64±6.57b 453.89±5.11a 404.61±5.60b <0.001 72 h总产气量 Total gas production in 89.08±2.51b 92.50±2.97b 94.38±1.52b 115.21±2.43a 90.16±2.10b <0.001 72 h/(mL/g) 潜在最大产气量 Potential maximum 91.24±3.07c 96.41±3.42bc 100.20±1.97b 117.36±2.79a 92.13±2.35bc <0.001 gas production/(mL/g) 总产气速率 Total gas production rate /( / h) 0.08±0.00a 0.07±0.00bc 0.06±0.00c 0.08±0.00ab 0.07±0.00ab 0.001 起始底物降解速率 0.01±0.00b 0.02±0.00ab 0.02±0.00a 0.02±0.00b 0.02±0.00ab 0.008 FRD0 /[mmol/(g·h)] 图 1 复合菌制剂对芦苇青贮饲料体外发酵 总气体生成曲线的影响 Fig.1 Effects of compound bacteria preparation on total gas production curve of Phragmites australis silage in in vitro fermentation 2.4 复合菌制剂对芦苇青贮饲料体内降解特性的 影响 由表 8可知 ,LA+AN 组和 LA+BS+AN 组 8、24和 48 h 的 DMD 显著高于其他 3组 (P <0.05),且 16 h 的 DMD 显著高于 LA+BS 组 (P <0.05);各 组间 72 h 的 DMD 无显著差异 (P >0.05)。 3 讨 论 3.1 复合菌制剂对芦苇青贮饲料营养成分的影响 本研究发现 ,添加乳酸菌能够显著降低芦苇 青贮饲料中的 DM 含量 ,而与黑曲霉菌和枯草芽 孢杆菌联用后能够提高其 DM 含量 。 CP 含量也 出现了同样的现象 ,与 CK 组相比 ,添加乳酸菌具 有降低 CP 含量的趋势 (无显著差异 ),添加枯草芽 孢杆菌和黑曲霉菌后显著提高了 CP 含量 。与本 试验结果类似 ,闫琦等 [23]研究发现 ,添加乳酸菌可 以显著降低菊芋茎叶青贮饲料 CP 含量 。任付 平 [24]研究发现 ,在青贮玉米青贮过程中利用黑曲 霉 、绿色木霉和枯草芽孢杆菌等处理后青贮饲料 DM 和 CP 含量都有所增加 。这可能是由于植物 本身的有害微生物以及各种酶对饲料大分子养分 的降解 ,从而导致养分和蛋白质的损耗 ,而补充枯 草芽孢杆菌和黑曲霉菌能帮助乳酸菌更快地营造 酸性厌氧环境 ,抑制有害微生物的繁殖 ,并降低青 贮发酵早期植物自身呼吸作用对 CP 的消耗 ,从而 降低蛋白质等大分子的损耗 [14-15],且较高的 DM 含量也可以抑制丁酸菌和大肠杆菌等有害菌的生 长繁殖 [25]。饲料纤维含量与反刍动物采食量和营 养物质消化率呈负相关 ,NDF 和 ADF 含量越低 ,饲料营养价值越高 [26]。本试验也发现 ,添加黑曲 霉菌有降低 NDF 含量的趋势 ,这与黑曲霉菌分泌 的多种酶如纤维素降解酶存在密切相关 ,许多研 究已经证明了黑曲霉菌在纤维降解方面的作 用 [27-29]。而唐振华等 [30]研究发现 ,无论是黑曲霉 菌还是黑曲霉菌组合其他菌种在饲料青贮发酵中 并没有显著降低 NDF 含量 ,这可能是添加量不足 导致其产生的高活性纤维素酶 、木聚糖酶等活性 不足导致 。 表 7 复合菌制剂对芦苇青贮饲料体外发酵参数的影响 Table 7 Effects of compound bacteria preparation on in vitro fermentation parameters of Phragmites australis silage 项目 组别 Groups P值 Items CK LA LA+BS LA+AN LA+BS+AN P⁃value pH 6.39±0.01b 6.30±0.01c 6.46±0.01a 6.45±0.01a 6.38±0.01b <0.001 氨态氮 NH3 ⁃N /(mmol/L) 16.33±0.06a 16.48±0.20a 15.31±0.34bc 14.79±0.44c 15.77±0.03ab 0.002 总挥发性脂肪酸 TVFA/(mmol/L) 70.26±0.51b 79.35±0.96a 60.01±1.50d 63.40±0.29c 68.78±0.88b <0.001 乙酸 /丙酸 Acetate / propionate 2.39±0.01a 2.35±0.00b 2.25±0.01d 2.23±0.01d 2.32±0.01c <0.001 VFA产氢量 RNH2 / ‰ 1 133.16±2.09a 1 124.10±0.50ab1 107.27±5.77c 1 098.60±1.69c 1 118.03±2.25b <0.001 挥发性脂肪酸 VFA/‰ 乙酸 Acetate 615.74±0.87 618.48±0.26 615.43±2.27 615.58±0.22 618.22±1.01 0.297 丙酸 Propionate 257.59±0.68e 262.57±0.29d 272.99±1.04b 276.70±0.69a 266.82±0.77c <0.001 丁酸 Butyrate 9.99±0.08a 9.49±0.03b 8.12±0.21c 7.61±0.06d 9.24±0.10b <0.001 异丁酸Iso⁃butyrate 85.32±0.29a 80.33±0.34b 78.85±0.65c 76.20±0.36d 78.13±0.17c <0.001 戊酸 Valerate 17.23±0.06a 15.86±0.03b 13.77±0.29d 12.75±0.13e 14.68±0.24c <0.001 异戊酸Iso⁃valerate 14.13±0.04a 13.61±0.15b 12.60±0.10c 10.82±0.06d 12.49±0.04c <0.001 表 8 复合菌制剂对芦苇青贮饲料 DMD 的影响 Table 8 Effects of compound bacteria preparation on DMD of Phragmites australis silage g/kg 降解时间 组别 Groups P值 Degradation time / h CK LA LA+BS LA+AN LA+BS+AN P⁃value 8 354.36±5.71c 353.51±3.85c 319.29±22.12c 374.76±16.90b 384.51±16.49a <0.001 16 368.12±2.67ab 364.65±6.35ab 363.79±7.69b 424.57±7.69a 461.42±9.45a 0.044 24 371.28±7.83d 368.02±14.07d 409.27±15.70c 491.30±13.24b 542.09±3.58a <0.001 48 420.17±13.33b 412.67±12.32b 417.59±11.26b 528.67±15.04a 546.67±14.20a <0.001 72 451.99±19.6 453.05±32.68 455.5±25.65 547.12±21.08 532.14±27.57 0.060 3.2 复合菌制剂对芦苇青贮饲料发酵品质的影响 感官评定能够在一定程度上反映发酵过程中 的环境控制和青贮饲料的发酵品质 ,本试验在芦 苇青贮过程中分别添加了乳酸菌 (植物乳杆菌 、戊 糖片球菌和布氏乳杆菌 )、枯草芽孢杆菌和黑曲霉 菌之后 ,各组的感官评定得分均无显著差异 。谢 婷霞等 [31]在皇竹草青贮过程中添加乳酸杆菌发现 对其色泽和 pH 评分有明显改善作用 。吴进东 [32] 也发现了类似结果 ,但其研究表示不同种类的添 加剂对青贮饲料的感官评定指标影响并不大 。本 试验中 ,各组青贮饲料感官评定得分均在 60~70分 ,评级均为良好 ,表示本试验发酵过程中无氧环 境的控制等较好 ,且各菌制剂添加对青贮饲料的 感官评定无有害影响 。 NH3⁃N 含量 、有机酸含量 和 pH 是反映发酵品质的重要指标之一 [33],其中 NH3⁃N 含量可以反映原料中 CP 的降解程度 ,NH3⁃ N/TN 值与青贮饲料的蛋白质降解程度呈正相 关 [34]。本试验中 ,LA+BS 组和 LA+AN 组 NH3⁃N 含量显著低于 CK 组 ,且最低的为 LA+BS 组 ,说 明枯草芽孢杆菌或黑曲霉菌单独与乳酸菌联用时 能够更有效地保存芦苇中的蛋白质 ,且枯草芽孢 杆菌在这方面具备更好的效果 。枯草芽孢杆菌是 一种兼性厌氧菌 ,已有研究表明 ,在青贮过程中添 加枯草芽孢杆菌可以改善饲料的发酵品质 ,并提 高其发酵后小分子蛋白质和游离氨基酸的含量 等 [24,35]。与本试验类似 ,多项研究结果表明 ,枯草 芽孢杆菌 [36]或者黑曲霉菌 [37-38]的添加可以显著 降低青贮的 NH3⁃N /TN 值 。 pH 是进行青贮饲料品质评价的简单有效的 指标 ,较低的 pH 可以抑制大部分有害菌的繁殖 ,提高发酵品质 ,延长青贮饲料的保质期 [39]。本研 究中各组 pH 在 3.8~4.2,青贮品质良好 ,且枯草芽 孢杆菌的添加可以显著降低发酵过程中的 pH 。有 机酸含量中 ,乳酸占比越高 ,丙酸和丁酸占比越 低 ,青贮发酵品质越好 [33]。乳酸的存在可以抑制 饲料中好氧微生物的繁殖 ,防止饲料在发酵过程 中腐败变质 [24]。本研究中 ,LA 组和 LA+AN 组乳 酸含量相较于 CK 组有所提高 ,且 LA+AN 组乳酸 含量较 LA 组高 ,而 LA+BS 组和 LA+BS+AN 组 乳酸含量较 LA 组出现显著降低 。与 CK 组和 LA 组相比 ,LA+BS 组 、LA+AN 组和 LA+BS+AN 组 乙酸含量显著降低 。 LA+BS 组和 LA+AN 组乳 酸 /乙酸值显著高于 CK 组 、LA 组和 LA+BS+AN 组 。这说明乳酸菌的添加可以提高饲料中乳酸含 量 ,且与黑曲霉菌联用后可以促进这种提高效应 ,而与枯草芽孢杆菌的加入会破坏这种提高效应 ,同时枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌与乳酸菌的联用会 降低发酵过程中乙酸的产生 。 LA 组 、LA+AN 组 和 LA+BS+AN 组丁酸含量显著高于 CK 组和 LA+BS 组 ,LA+BS 组丁酸含量显著低于其他各组 ,说 明枯草芽孢杆菌和乳酸菌的联用能够抑制发酵过 程中丁酸和丙酸的产生 ,而黑曲霉菌加入会抑制 这种作用 。 综上所述 ,枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌单独与 乳酸菌联用作为添加剂均能在一定程度上改善青 贮饲料的发酵品质 ,且是通过不同的原理改善发 酵品质 ,黑曲霉菌在降低发酵过程中的 NH3⁃N 含 量 、提高乳酸含量方面更具优势 ,而枯草芽孢杆菌 在降低发酵过程中的 pH 及 NH3⁃N 、乙酸和丁酸含 量方面更具优势 。黑曲霉菌为好氧微生物 ,一般 在发酵初期迅速繁殖并消耗大量氧气 ,加速无氧 环境的形成 ,使发酵环境向乳酸菌等厌氧菌的适 宜环境转变 。研究表明 ,其在发酵过程中能产生 纤维素酶 、木聚糖酶 、果胶酶和木质素降解酶等多 种酶 ,因此能快速降解饲料中的纤维素 ,为乳酸菌 繁殖提供所需营养的营养物质 ,从而提高乳酸的 含量使 pH 降低 [40]。枯草芽孢杆菌也是一种有益 的微生物菌制剂 ,能够有效改善青贮发酵品质 。与本研究相似 ,穆胜龙等 [41]研究发现枯草芽孢杆 菌和布氏乳杆菌联用可以显著降低甘蔗尾青贮饲 料中的 NH3⁃N 含量 ,提高有氧稳定性 ,从而改善青 贮品质 。 3.3 复合菌制剂对芦苇青贮饲料瘤胃发酵特性的 影响 在体外发酵试验中 ,黑曲霉菌与乳酸菌的组 合能够显著提高 DM 消失率 、72 h 总产气量和潜 在最大产气量 ,而其余几种组合并没有太好的提 升效果 ,这说明黑曲霉菌与乳酸菌的组合能够提 高瘤胃对营养物质的利用率 。瘤胃 pH 能够影响 其微生物菌群 ,从而影响瘤胃发酵效果 ,本试验中 LA+AN 组和 LA+BS 组出现发酵液 pH 升高的现 象 (但均在正常瘤胃液变化范围之内 ),可能与发 酵过程中的 VFA 产生有关 ,其发酵液中具有更低 的总挥发性脂肪酸含量和 RNH2,导致发酵液 pH 偏 高 。作为碳水化合物在瘤胃中的发酵产物 ,瘤胃 VFA 是反刍动物重要的能量来源 ,本试验中 ,LA+AN 组丙酸含量高于其他组 ,乙酸 /丙酸值及丁酸 、异丁酸 、戊酸和异戊酸含量低于其他组 。在尼龙 袋试验中发现 ,LA+AN 组和 LA+BS+AN 组 8、24和 48 h 的 DMD 均有一定程度的提高 ,表明黑曲 霉菌与乳酸菌的组合或 3种菌的组合添加能够提 高青贮芦苇在瘤胃中的利用率 。本试验结果表 明 ,黑曲霉素与乳酸菌联用能够在一定程度上提 高营养物质在瘤胃中的消化利用率 ,改善瘤胃的 发酵环境 ,从而提高发酵效果 。 4 结 论 乳酸菌与枯草芽孢杆菌或者与黑曲霉菌联用 对芦苇青贮饲料的营养成分 、青贮发酵品质 、瘤胃 体外发酵特性和体内消化均有一定的改善作用 。综合考虑 ,在本试验添加量下 ,乳酸菌和黑曲霉菌 联用对芦苇青贮品质 、瘤胃体外发酵和体内消化 的改善效果最好 。 参考文献 : [ 1] 李建国 ,李贵宝 ,刘芳 ,等 .白洋淀芦苇资源及其生态 功能与利用 [ J ] .南水北调与水利科技 ,2004,2(5):37-40.LI J G ,LI G B ,LIU F ,et al.Reed resource and its ec⁃ological function &utilization in Baiyangdian lake [ J ] .South⁃to⁃North Water Transfers and Water Science &Technology ,2004,2(5):37-40.( in Chinese ) [ 2] 刘敏 .加快洞庭湖区产业综合开发利用的思考 ———以芦苇产业为例 [ J ] .长江技术经济 ,2019,3(3):42-46. 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Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science , Yueyang Academy of Agricultural Sciences , Yueyang 414000, China ) Abstract : The purpose of this study was to investigate the effects of compound bacteria preparation ( including homogeneous Lactobacillus / heterogeneous Lactobacillus , Bacillus subtilis and Aspergillus niger as well as their compatibility ) on nutrient composition , fermentation quality and rumen fermentation characteristics of Phrag⁃mites australis silage. Taking growing Phragmites australis from Dongting lake as silage material , five groups were set up , which were blank group (CK group ), lactic acid bacteria group (LA group , supplemented with Lactobacillus plantarum , Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus buchneri ), lacticacid bacteria+Bacillus subtilis group (LA+BS group ),lacticacid bacteria+Aspergillus niger group (LA+AN group ) and lactic acid bacteria+Bacillus subtilis +Aspergillus niger group (LA+BS+AN group ), and each group had 3 replicates. The supplemental level of lacticacid bacteria was 1.5×108 CFU/kg silage raw materials , and the supplemental lev⁃els of Aspergillus niger and Bacillus subtilis were 1.0×108 CFU/kg silage raw materials ( all were based on fresh weight of silage raw materials ) . After 60 days of silage , the nutrient composition and fermentation quality of Phragmites australis silage were determined , and the rumen fermentation characteristics were evaluated by in vitro fermentation and in vivo degradation. The results showed as follows :1)the contents of dry matter and ash in LA , LA+BS and LA+AN groups were significantly lower than those in CK group (P <0.05), and the crude protein content in LA+BS , LA+AN and LA+BS+AN groups was significantly higher than that in CK and LA groups (P <0.05) . 2) The silage sensory evaluation scores of all groups were 60 to 70 points , and the ratings were good. The comprehensive scores of fermentation quality in LA+BS and LA+AN groups were higher ,a⁃mong which , the ammonia nitrogen to total nitrogen ratio , acetic acid content and acetic acid to total acid ratio in LA+AN group were significantly decreased compared with CK group (P <0.05), while the lactic acid con⁃tent and lacticacid to total acid ratio were significantly increased compared with CK group (P <0.05) . 3) The dry matter disappearance rateand total gas production of in vitro fermentation in LA+AN group weresignifi⁃cantly higher than those in the other groups (P <0.05), and in vitro fermentation parameters such as volatile fatty acid contents in fermentation liquid were improved. 4) The rumen fermentation dry matter degradation ratein LA+AN and LA+BS+AN groups at 8, 24 and 48 h was significantly higher than that in the other three groups (P <0.05) . In conclusion , the combined application of lactic acid bacteria and Aspergillus niger with supplemental levels in this experiment has the best effect on the quality of Phragmites australis silage and ru⁃men fermentation characteristics.[Chinese Journal of Animal Nutrition , 2023, 35(4):2443⁃2454] Key words : Phragmites australis ; compound bacteria preparation ; silage ; fermentation quality ; rumen fer⁃mentation characteristics

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