EVIDENT共聚焦助力Cell封面发文揭示无膜细胞器异常导致周围神经病的关键机制

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腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth neuropathies，CMT）是一组临床上常见的周围神经遗传病，发病率约为1/2500。根据致病基因的不同， CMT可分为几十种不同的亚型。就CMT患者总数而言，在全国范围内是一个非常庞大的数字，然而具体到某些亚型的患者数量却非常稀少，因此CMT被收录到国家《第一批罕见病名录》。长久以来令人困惑的是，这几十种CMT致病蛋白在细胞中的定位和生理功能各异，似乎没有任何明显的共性，然而这些突变蛋白却会导致CMT患者表现出非常相似的临床症状。这个被称之为“疾病遗传异质性”的谜团长期以来一直困扰着广大神经科学家和临床工作者。有没有可能不同的致病蛋白最后通过一个“殊途同归”的共同机制引发相似症状？在过去几十年的研究中，领域内逐渐形成了一个共识：大多数神经系统疾病的发生都是遗传因子和环境应激因子共同作用的结果[1, 2]。当细胞面临各种不良环境刺激时（如营养缺乏、高温、辐射等），细胞内一个重要的应激机制就是形成应激颗粒（Stress granule，SG），SG的形成可以避免蛋白的错误翻译，有效地组织利用细胞中各种信号分子和能量资源，使细胞更好地应对环境中的不良刺激，提高细胞存活率[3, 4]。近年来越来越多的证据表明，SG在多种神经退行性疾病中扮演了非常关键的角色，其功能主要是与肌萎缩侧索硬化相关疾病中蛋白沉淀的形成相关[5-7]，而CMT是不产生蛋白沉淀的周围神经病，应激颗粒是否参与到CMT疾病中尚未有研究[8-10]。2023年2月3日，浙江大学医学院脑科学与脑医学学院白戈课题组与合作者在Cell杂志( IF=66.850 (2022) / JCR分区: Q1 )以封面文章形式在线发表了题为“Diverse CMT2 Neuropathies are Linked to Aberrant G3BP Interactions in Stress Granules“ 的研究论文。该工作发现虽然在正常生理状态下不同CMT致病蛋白在细胞中的定位各异，但在应激状态下这些CMT致病蛋白会表现出相同的细胞定位，进入应激颗粒中并与其核心蛋白G3BP发生异常互作，引起应激颗粒异常，使得周围神经应对环境不良刺激的能力下降，从而导致周围神经病的发生。该研究首先使用浙江大学医学院公用技术平台Olympus FV3000激光共聚焦显微镜（FV4000激光共聚焦现已发布），在HeLa细胞、鸡胚运动神经元和小鼠原代培养运动神经元中确定了导致CMT2D亚型的GlyRS蛋白能够在应激状态下进入到应激颗粒中（图1），同时利用该显微镜的时间序列和FRAP成像模块获得数据揭示了GlyRS致病蛋白对神经元生长长度影响及GlyRS致病蛋白对应急颗粒动态性的影响。图1. GlyRS蛋白在应激下定位到SG中。A-C：HeLa细胞中野生型和突变型的GlyRS蛋白在应激状态下进入到SG中，并与SG核心蛋白G3BP1发生共定位。D-F：在鸡胚脊髓运动神经元中验证体内GlyRS与G3BP1蛋白共定位。G-I：在小鼠原代培养运动神经元中确定了內源性GlyRS与G3BP1蛋白发生共定位。随后研究人员通过活细胞荧光成像、邻近标记、定量蛋白质谱、STORM超分辨成像等技术发现，GlyRS突变蛋白与G3BP的异常相互作用不会影响SG组装-解聚的动态变化，却会显著干扰以G3BP为核心的SG蛋白网络，导致大量非SG组分异常滞留在SG中，从而扰乱了细胞正常的应激反应，导致运动神经元抵御外界不良环境刺激的能力明显下降，更易发生轴突退变（图2）。研 究 人 员 还 进 一 步 鉴 定 出 了 GlyRS 突 变 蛋 白 与 G3BP 的 结 合 位 点 位 于 其 “ 内 在 无 序 区 ”（Intrinsically disordered region, IDR），通过破坏二者的异常结合，能够消除GlyRS突变蛋白对SG的干扰，改善运动神经元抵抗不良环境刺激的能力，有效缓解CMT2D小鼠模型的疾病症状 （图2）。图2. 不同CMT2蛋白的共性致病机制。最后，研究人员还发现这个机制可以进一步扩展到其他CMT2亚型。通过对20几种不同类型CMT2致病蛋白进行测试，研究人员发现这些原本定位在细胞内不同部位的蛋白质，在应激条件下大部分都可以进入SG并且与G3BP发生异常相互作用，引起SG异常，导致运动神经元应对环境不良刺激的能力下降。这些发现表明应激颗粒异常很可能是介导不同亚型CMT的共性致病机制（图2）。综上，该工作揭示了应激颗粒异常是介导不同亚型CMT的共同致病机制，为针对多亚型CMT的广谱治疗药物的开发提供了重要理论基础，也为其他疾病遗传异质性的机制研究提供了新的思路。本文中多色荧光标记的细胞图像都是采用Olympus激光扫描共聚焦FV3000拍摄。FV3000的全真光谱技术可以自由调整标记荧光信号的收集波段，并有效防止不同标记之间的荧光串扰，帮助用户获取更加真实可靠的数据。另外，本文还利用FV3000观察了活细胞中的G3BP1液滴以及通过FRAP实验验证了其相分离特性。FV3000灵活高效的龙卷风光刺激模式以及追踪运动中的液滴并分析其漂白区域荧光强度变化的功能，是帮助用户进行相分离 研究的利器。浙江大学双脑中心、浙江大学医学院脑科学与脑医学学院白戈研究员与中国科学院分子细胞科学卓越创新中心李劲松院士为本文的共同通讯作者。博士后崔琴琴、毕洪运、吕占云，博士生武琪贵、华剑锋、谷博凯为本文共同第一作者，博士后霍婵娟、唐明敏等也为本研究做出重要贡献。本研究还得到了刘华清、杨培国、金志刚、吴志英、章永登、沈承勇、盛能印等教授的大力支持，并得到了段树民院士、胡海岚、景乃禾、李党生、唐北沙、张宏、杨兵、蒋超、张轲、孙启明、彭广敦、郭天南、张如旭、刘聪、陈万金、赵国华、Sam Pfaff（Salk Institute）、Xiang-Lei Yang（TSRI）等教授的指导和帮助。该研究主要受国家自然科学基金委“原创探索计划”、“器官衰老与器官退行性变化的机制”重大研究计划、科技创新2030重大项目等资助。[1]. Saxena, S. and P. Caroni, Selective neuronal vulnerability in neurodegenerative diseases: from stressor thresholds to degeneration. Neuron, 2011. 71(1): p. 35-48.[2]. Goldman, S.M., Environmental Toxins and Parkinson's Disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2014. 54(1): p. 141-164.[3]. Protter, D.S.W. and R. Parker, Principles and Properties of Stress Granules. Trends in Cell Biology, 2016. 26(9): p. 668-679.[4]. Kedersha, N., P. Ivanov and P. Anderson, Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci, 2013. 38(10): p. 494-506.[5]. Wolozin, B. and P. Ivanov, Stress granules and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci, 2019. 20(11): p. 649-666.[6]. Li, Y.R., et al., Stress granules as crucibles of ALS pathogenesis. J Cell Biol, 2013. 201(3): p. 361-72.[7]. Murakami, T., et al., ALS/FTD Mutation-Induced Phase Transition of FUS Liquid Droplets and Reversible Hydrogels into Irreversible Hydrogels Impairs RNP Granule Function. Neuron, 2015. 88(4): p. 678-90.[8]. Motley, W.W., K. Talbot and K.H. Fischbeck, GARS axonopathy: not every neuron's cup of tRNA. 2010. 33(2): p. 59-66.[9]. Antonellis, A., et al., Functional analyses of glycyl-tRNA synthetase mutations suggest a key role for tRNA-charging enzymes in peripheral axons. J Neurosci, 2006. 26(41): p. 10397-406.[10]. Nangle, L.A., et al., Charcot-Marie-Tooth disease-associated mutant tRNA synthetases linked to altered dimer interface and neurite distribution defect. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(27): p. 11239-44.