【求助】如何才在不破坏蛋白的情况下将蛋白沉淀了?

活到九十 学到一百 2008/04/15

1.采用专一吸附富集和洗脱的亲和柱，比如HisTag之类的，将蛋白质吸附，如有需要可以进行洗脱。 2.借助抗体吸附蛋白，然后离心沉淀。 3.超滤。超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质，是一种温和的、非变性的物理分离方法，尤其适用于蛋白质等大分子溶液的浓缩，纯化以及缓冲体系交换等。超滤操作最简单的工具莫过于离心超滤管----通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂透过超滤膜,被收集在滤过液收集瓶中，而大分子溶质则被超滤膜截流在样品浓缩管中。

wbp 2008/04/16

[quote]原文由 [B]wangboxzzjs[/B] 发表: 1.采用专一吸附富集和洗脱的亲和柱，比如HisTag之类的，将蛋白质吸附，如有需要可以进行洗脱。 2.借助抗体吸附蛋白，然后离心沉淀。 3.超滤。超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质，是一种温和的、非变性的物理分离方法，尤其适用于蛋白质等大分子溶液的浓缩，纯化以及缓冲体系交换等。超滤操作最简单的工具莫过于离心超滤管----通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂透过超滤膜,被收集在滤过液收集瓶中，而大分子溶质则被超滤膜截流在样品浓缩管中。[/quote] 不推荐离心超滤管,理论是很完美,用起来不是那么回事,经常堵,离不下去,影响定性定量，离心超滤管又挺贵。亲和柱和抗体吸附蛋白不是不可以，成本更是贵的吓人，亲和柱都在300 RMB一支以上。做蜂王浆的兽药检测，建议采用SPE处理，适用得多。

It is me! 2008/04/18

[quote]原文由 [B]cuiyanhu[/B] 发表: 我在做蜂王浆的前处理,我做沉淀蛋白,但还不给用破坏蛋白的方法,谁的没有高招,请指点一二,在下非常感谢!!!!!!!!!!![/quote] 不知你最终研究的物质是什么？里面的活性蛋白？建议你用NH4SO4或者乙醇处理。建议浓度阶梯增加，逐层取出沉淀物质，因为里面多糖比较多（慢慢会出现漂浮物质），这样可以略微好一些。不过NH4SO4不能保证所有的蛋白都能 沉下来，活性也不能保证完全。。目前还没有万能的纯化蛋白的方法。对于不同性质的蛋白需要不同的尝试。

happyjyl 2008/04/18

楼主是想制备不含蛋白质的样品溶液吧？下面是网上搜来的，供你参考。 [B]蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)蛋白质便容易凝集析出。[/B] 　　如将蛋白质溶液pH调节到等电点，蛋白质分子呈等电状态，虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。 　　引起蛋白质沉淀的主要方法有下述几种： 　　(一)盐析(Salting Out) 　　在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，[B]盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。[/B]　　 (二)重金属盐沉淀蛋白质 　　蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。 　　临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 　　(三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 　　蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。 　　临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 　　(四)有机溶剂沉淀蛋白质 　　可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。 　　(五)加热凝固 　　将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固(coagulation)而沉淀。加热首先是加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。 　　蛋白质的变性、沉淀，凝固相互之间有很密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。例如，蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱和强酸溶液的pH调节到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。

头文字D 2008/04/15

有没有使蛋白聚合的途径？