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【原创】导数光谱法理论基础研究

初学者&九点虎

2008/04/10

紫外可见分光光度计（UV）

导数光谱法理论基础研究

在普通吸光光度法中，如果吸光度很小，就不能得到精度很好的信号。如果其他组分的吸收重叠在吸收峰上，测定就会受干扰。导数光谱法采用微分求导,在谱图上显示出微小的变化,使光谱图的分辨率得到了很大的提高.导数光谱的特点在于灵敏度高，可减小光谱干扰。因而在分辨多组分混合物的谱带重叠、增强次要光谱(如肩峰)的清晰度以及消除混浊样品散射的影响时有利。
1导数光谱的优势
导数光谱法有一般分光光度不具有的优势,主要表现在以下几个方面:
1.1能分辨两个或两个以上完全重叠的或很小波长差相重叠的吸收峰.
1.2能够分辨吸光度随波长急剧上升所掩盖的弱吸收峰(有人称为肩峰)
1.3能够确认宽阔吸收带的最大吸收波长
以上从谱图角度来将,从灵敏度角度来说,提高了不少,应该说很多.我曾经这么说过,一台可以进行导数光谱的紫外分光光度计,可以赶上一台带紫外检测器的HPLC,可能有点夸张,至少我个人这么认为.
1.4灵敏度
关于导数吸光光度法提高灵敏度的规律，有人指出n阶（n＝1～4）导数吸光光度法的灵敏度是按4.5n倍增大。
2理论基础
2.1定量基础
其原理是因为吸光度和摩尔吸光系数为波长的函数，所以朗伯-比尔定律可以用下式表示：
Aλ＝ελcl
将上式对波长进行一次微分，得

若对波长进行n次微分，可得

2.2导数光谱图的处理
吸光度对波长进行微分的微分值与吸收物质的浓度成正比,符合朗伯-比尔定律，因此它可以用于吸收物质的定量分析。
获得导数光谱的方法可分为光学微分法和电学微分法两类.现在很多带计算机的工作站都采用电学微分法,通常可以获得一、二、三、四阶导数光谱。比如俺现在用的2550,就能做到四阶.
俺还是以纳他霉素为例进行说明,顺便插一句,我就是从做纳他霉素这个项目开始才接触导数光谱的,所以,我下决心把这一块搞明白了,因为好多书上都没有写,就是有写的,也是简单的一两句就过去了,曾经让我很郁闷,所以我下了这个决心,就这点东西,俺就不信了.

上图为那他霉素的0-4阶导数光谱图,以下问题就围绕这些图进行说明.
3导数光谱图的获得
这里就不多说了,我在另一片论文中有详细说明.
见周玉虎 <<导数光谱采集及处理方法研究>>
4导数值的测量方法
导数光谱的测量很多,下面分别说明
4.1如果基线是平坦的，可以测量峰-谷之间的距离，这是最常用的方法。
4.2在基线平坦的情况下，也可以测量峰-基线之间的距离，这时灵敏度虽有些降低，但精度较高。
4.3作两峰的连接线，测量两峰连线到谷的距离。只要基线是直线，不管它是否倾斜，总能得到正确的值。
4.4作峰顶与谷顶的切线，使其平行于基线，然后测量两平行线的距离。
以上四种方法,是前辈们总结的,非常经典的方法,但是现在,尤其是带导数处理工作站的,不具备4.3和4.4的功能,采用峰值检测,能实现4.1和4.2,而我个人认为,4.1和4.2也存在着一定的误差,所以,我重点介绍的方法马上就要闪亮登场了---积分面积.
4.5积分面积
积分面积是UVPROBE软件带的一个功能,我拿标样做了很多试验,我觉得它定量很准确,至少比4.1和4.2准确,所以我强烈推荐这种方法.之前我还不敢肯定自己的这种方法,因为在文献中从来没有见过,写了好几篇论文也没有发表.后来一次机会降临在我头上,幸运之神啊!!!在一次讲座上,正好是李昌厚教授讲课,中间休息的时候,我当面请教了李教授,得到了他老人家的肯定.所以现在,我更坚持自己是对的.
其公式如下:
计算前需要定义计算的区域，要给出开始和结束波长值 (光谱)或开始和结束时间值 (动力学)。峰面积计算给出指定区域的面积值。
为什么现在没有普遍应用吗?我觉得是带积分面积,有工作站的仪器比较少,限制了这种方式的发展.但我个人认为,以上四种方式是很早以前文献上报道的,在最近十几二十年几乎没有更新,只适合于手工积分、手工求导的计算方式,不适应现在仪器、软件、及计算机发展的需求.所以,本人认为采用峰面积进行积分.用面积积分有以下几个优点:
(1) 克服了噪声对测定的影响,在那他霉素标准曲线第一点上,若用峰高,其值为0.002,用峰面积为0.033,而0.002的吸光度很难说明问题,是那他霉素的吸收值呢,还是噪声引起的呢?而采用面积,就不存在这个问题,或影响非常小.
(2) 用峰高积分,线性不太好,相关系数>0.99,有时甚至很差;而用峰面积线性良好,相关系数>0.9995,符合试验测定要求.
(3) 检出限:用峰高测定时,其检出限为0.2186mg/L,用峰面积时, 检出限为0.0968,从数据可以看出,峰面积的检出限低.
下面是我自己做的一些结论,,当然也存在很多疑惑,希望和大家分享.
当采用面积积分时,基线不为零,积分结果为5.175

当基线为零时,积分结果为14.951,见下图,

不知道两者积分有什么区别???

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初学者&九点虎

第1楼2010/05/23

图没传上来，刚发现

0

coffee8

第2楼2010/05/23

太深奥了吧？有多少人看得懂呀？我看一会头都大了！高等数学微积分学的不好，有难度！

0

初学者&九点虎

第3楼2010/05/25

其实仪器都能做，不用自己做数学计算的
coffee8(coffee8) 发表:太深奥了吧？有多少人看得懂呀？我看一会头都大了！高等数学微积分学的不好，有难度！

0

icestone-tea

第4楼2011/03/21

把图放上来吧，这样更容易看明白！
“一台可以进行导数光谱的紫外分光光度计,可以赶上一台带紫外检测器的HPLC”
这句话看的我很心动啊，^_^

0

dxqqin

第5楼2011/09/14

我想请教一下面积积分法是不是要求被测物质的纯度特别高？没有经过提纯的可不可以用？

0

dxqqin

第6楼2011/09/14

能不能给我推荐一些面积积分法同时测量三物质的文章，谢谢！

0

mengzhaocheng

第7楼2011/09/17

应助达人

如果不能及时回复，楼上版友可以直接给我们版块专家直接发短消息的。

0

suiniubei

第8楼2012/08/20

　　导数光谱法在有较多杂质干扰时不太稳健．

0

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