【分享】欧盟兽药检测方法（之十九）

7 仪器和设备
7.1 塑料离心管: 100mL
7.2 玻璃漏斗: 77mm直径
7.3 全玻璃过滤器,47mm直径
7.4 玻璃样品瓶, 5mL, 25mL
7.5 梨形瓶, 50mL, 100mL
7.6 反应瓶:3mL，具聚四氟乙烯内衬拧盖
7.7 玻璃注射器：1 mL , 10 mL
7.8 高速均质器
7.9 混合器
7.10 旋转蒸发器， 水浴温度40 C
7.11 玻璃小瓶：自动进样器用
7.12 塑料注射器： 1mL，一次性
7.13 离心机：IECCentra-7R型或相当者
7.14 超声水浴：L&R 140S或相当者
7.15 可调移液器：5 mL
7.16 滤纸：15 cm
7.17 膜过滤器：Millipore Swinner 不锈钢型， 13 mm
7.18 过滤膜：13 mm, 47 mm
7.19 固相萃取器
7.19.1 真空洗脱支架（固相萃取支架）
7.19.2 C18 小柱， 500 mg
7.19.3 硅胶小柱， 500 mg
7.19.4 柱用针头
7.19.5 柱洗脱储液缸：50 mL。
7.20 液相色谱条件
色谱柱：20 cm X 3 mm 内径，内填Chromspher C8，附带反相保护柱，10 mm X 2.1 mm 内径，粒径30-40 um
流动相流速：0.4 mL/min
荧光检测器：激发波长312 nm, 发射波长 355 ， 狭缝宽度均为10 nm
进样体积 20 uL

8 样品和采样程序
注：有关要求引自ISO文件78/2-1982中6.3.1节或2052/VI/84-EN中附2 。
8.1 样品性状：样品应符合64/433/EEC指令中，检测肉（牛奶）中药物残留的要求。
8.2 样品量： 样品量应满足进行测定和复验所需的量。
8.3 应按实验室鉴定的适当要求进行取样和封装。
8.4 对样品的封装、保存和运输应能保证样品的完整，不会引起结果的偏差。
8.5 用于分析苯并咪唑类物质的样品应在-18 C 以下储存和运输。

9 测定步骤
9.1 取5g 经仔细破碎的样品或5 mL 牛奶于离心管中，加入15 mL乙腈。
9.2 加入25 mL 乙酸乙酯，均质4 min, 于2 500 rpm离心5 min。
9.3 上清液通过装有无水硫酸钠的相分离滤纸过滤到100 mL 梨形瓶中。
9.4 重复9.2和9.3
9.5 将滤液合并，旋转蒸发至约1 mL。
9.6 小柱使用前用5 mL正己烷-三氯甲烷（60：40）和乙腈处理。然后用3 x 2 mL 正己烷-三氯甲烷（60：40）予淋洗。将残余液转移入该硅胶小柱中。
9.7 待小柱干后，用2 mL 甲苯洗脱，空气干燥。
9.8 用10 mL 丙酮洗脱苯并咪唑类。
9.9 将丙酮旋转蒸发干，残渣用3 X 2 mL甲醇-水（10：90）转移入C18小柱。
9.10 待小柱干后用10mL 乙腈洗脱苯并咪唑入玻璃样品瓶中。
9.11 将洗脱液转移入50 mL梨形瓶，用2 X 2 ml 乙腈洗涤上述样品瓶壁并入梨形瓶。
9.12 在40 C 水浴下将有机相旋转蒸发至干。
9.13 用1 ml HPLC流动相溶解残渣。
9.14 校正曲线标准
于9.7步添加标准，浓度为0-5ug/kg，制定标准曲线。
9.15 HPLC 进样量，20 ul。

10 结果计算
10.1 绘制0-5ug浓度范围的峰高-浓度标准曲线。从测定峰高计算每次进样的样品中每一种苯并咪唑的量。由此数据结合进样体积和回收率算出以 mg/kg表示的浓度。20 ul标准进样量相当于100 mg的萃取样品。
测定的苯并咪唑的量
回收率（%）= —————————————X 100
添加量
样品中苯并咪唑的浓度：
从曲线测得苯并咪唑的量ug 1 100
C (mg/kg)= ———————————— X ———— X ———
1000 0.05 回收率%
如果样品中苯并咪唑浓度超过标准曲线的浓度范围，应将萃取液稀释后进行色谱分析，并将体积进行校正。
10.2 检测限
该法对所有组织样品中四种苯并咪唑的最低检测限均为0.02 mg/kg。
10.3 质量保证
10.3.1 确证：一组6个空白样品分别添加0.05或0.1 mg/kg浓度的所有四种苯并咪唑药。每3天进行一次萃取和分析。每批包含以下样品；
2个空白样；2个标准添加样（从9.7开始添加）0.05mg/kg；2个标准添加样0.1mg/kg；6个回收率添加样（从萃取前开始添加）0.05mg/kg或0.1mg/kg。
回收率应在60-90%，批样品内和批样品间的变异系数应在5-15%。
10.3.2 从挪威MAFF获得的质量保证数据举例
牛奶：测得的牛奶中10ug/l苯并咪唑的回收率数据，第一天3个样品，第二天5个样品，第三天4个样品。
丙硫米唑（Albenszole sulphone）77±3% cv=4% （Thiobendazole） 5３±6% cv=11%
氧苯哒唑（Oxfendaxole） 70±4% cv =6% 噻苯达唑（Cambendazole） 52±6% cv=12%
肝：测得的肝中20ug/kg苯并咪唑的回收率数据，每天6个样品，连续三天。
丙硫米唑（Albenszole sulphone）90±10% cv=11% （Thiobendazole）
氧苯哒唑（Oxfendaxole）71±9% cv =13% 噻苯达唑（Cambendazole） 82±13% cv=13%

11 特殊事例
当出现阳性结果时，可疑峰可通过停流分析发射光谱进行确证。
牛奶中未检出过噻苯达唑，故可将噻苯达唑用作内标。

12 操作步骤说明
每天可以处理10个样品作为一批，用HPLC连夜测定。一批可包含回收添加样品和未知样品。

13 控制样品
前期分析未检出苯并咪唑的样品可作为空白样品。

（14-15略。）

16 检测流程图
动物组织—加入乙酸乙酯—均质—硅胶柱—C18柱—HPLC—结果计算