【哺育新手活动】血浆中化合物A的HPLC-UV分析方法的建立（已上图片）

3 色谱条件的建立
这是过程可能很短很简单，也可能很漫长很费事，关键和很多因素有关，如化合物的性质、实验室现有的条件、成本、检测对灵敏度的要求等等，总之，就是要在满足检测要求的前提下，分析测试时间越短、成本越低、操作越简单越好。

1）检测波长的选择
文献报道的检测波长有225nm和275nm。一般说来（也有化合物例外），化合物在低波长段信号响应会好些，但是干扰也多，随着波长的增加，干扰会逐渐降低。不确定这两种波长的响应究竟差多少，我就拿紫外扫描了一下，的确225nm左右有最大吸收，而275nm处吸收太低，不可能满足我检测的要求，所以选择225nm作为我的检测波长。
很希望275nm处有强的紫外吸收，这样就算比225nm处稍微响应低些，但是干扰少，基线平，色谱条件建立起来容易啊，可惜……

2）色谱柱、流动相和内标的初步选择
选择色谱柱主要是参考文献和实验室现有色谱柱的情况， C18柱（ODS柱）适合大多数非极性样品的分析，如果样品极性大，可以选择氨基柱、腈基柱和HILIC柱等，也可以选择正相系统。只是从反相系统向正相系统过渡的时候要注意，不然会引起整个系统的堵塞。
我需要测定的物质A极性不大，文献报道基本都是C18柱，所以就用我们实验室最常用、储备也比较多的几根柱子开始摸条件，如Waters Symmetry C18，Agilent ZORBAX SB C18等（当然也是考虑了流动相的性质）。
流动相考虑到成本和毒性，决定先试甲醇，水相就参考文献配了25mmol/L的KH2PO4溶液（pH3.0）。
内标先试用了实验室现有的化合物，但是均与A的保留时间差的比较大，且相对靠前（血浆样品容易有干扰）。后来选用了文献报道的化合物B，出峰在A的后面，干扰少。
总共比较了Waters Symmetry C18(4.6×150mm, 5μm) 、Waters Symmetry C18(4.6×75mm, 3.5μm)和Agilent ZORBAX SB C18(4.6×150mm, 5μm)三根柱子，最后选择了第二根色谱柱（尽管没有文献报道是用这么短的柱子的），原因是：
1. Waters的这两根柱子都是Symmetry C18的，差别是长度和粒径，短柱子样品出峰快，样品与内标分离效果好，但是就是柱压高些。
当用150mm的柱子进样，甲醇:水相＝72:28(v:v)，1ml/min, 225nm, 柱温35℃时，样品A的保留时间是tR=8.2min，内标B的保留时间tR=14min左右。这样的进样时间对于我来说太长了， 2300多个样品，保留时间的长短直接影响到我的进样时间，我希望保留时间再短些，这就意味着有机相的比例还要增加，但是由于水相有盐，有机相太高怕析出，而且成本也会增加，所以就选择了短柱。
2. Agilent的柱子样品和内标的分离效果没有远没有Waters的好，如果要分开，那么两者的保留时间又会大于10min，但是柱压明显比Waters的低。

3）色谱条件的优化及前处理方法的选择
我的原则就是前处理越简单越好，分析时间越短越好，分析成本越低越好。
1．先拿样品及内标的对照品来初步确定色谱条件
当然这只是初步看一下，看看标准品进样，灵敏度怎样，是否需要浓缩样品，内标和样品峰分的怎么样等等。

2．根据检测要求选择最方便的前处理方法
根据我的检测要求，LLOQ最少要做到500ng/mL，当然能低更好。看看我的灵敏度，用蛋白沉淀法应该没有问题，当然前提是没有内源性干扰。于是试了几种最常用的沉淀剂：甲醇、乙腈和甲醇硫酸锌。
一般三者加的量是甲醇硫酸锌最少、乙腈次之、甲醇最多，当然是为了保证蛋白能充分沉淀。加的沉淀剂越少，样品稀释就越少，可能就会有更高的灵敏度。
结果，硫酸锌沉淀响应最好，峰也窄，而甲醇和乙腈沉淀样品峰响应相差不大，但乙腈沉淀峰更宽些，因此先选择用甲醇硫酸锌沉淀。


三种沉淀剂比较（其中硫酸锌沉淀样品的进样量为其余两种的1/2）,1是样品峰，2是内标峰。

3．优化色谱条件
确定好了色谱柱、流动相、内标和前处理方法，下面就是要正式开始优化条件了，有干扰的避干扰，能缩短分析时间就缩短分析时间。
1）首先调节流动相比例、柱温，使得样品峰和内标能够分开，且总的分析时间在10min以内。
2）做空白血浆加标的样品，看有无干扰。果然，不出所料，样品峰和内标处均有干扰，继续优化流动相比例、柱温、流速等参数，样品峰处基本无干扰了，但是干扰峰始终在内标峰出徘徊。
3）下面开始了排除血浆干扰的优化工作。
A．走梯度：甲醇走梯度，基线波动太大，有机相换成乙腈，样品峰响应下降，峰变宽，也不合适，失败。

甲醇走梯度



有机相改成乙腈


B．前处理改用提取：虽然不愿意，但是用乙醚还是试了一下，结果，提取还是有干扰，也不行。
C．改变流动相水相的pH值：调了几个pH值 3.0, 3.6, 4.3，结果发现，干扰峰对于流动相的pH值比较敏感，随着pH值的升高，干扰峰的保留时间会降低，当然样品峰和内标峰也会有同样的趋势，只是没有干扰峰那么敏感。最后把pH值调成3.4时，干扰峰终于可以在样品峰和内标峰中间出峰。而且做了6份不同来源的血浆，干扰峰均在样品峰和内标峰中间出峰。
pH 4.3


pH3.6


pH3.0


pH3.4


4）但是新的问题出来了，样品峰和内标峰的保留时间出现了漂移，老是不稳定，怀疑可能缓冲液的缓冲能力不够，于是缓冲盐的浓度加大了一倍，果然，保留时间稳住了，呵呵！

5）下面开始配血浆标准曲线，看线性。线性还是很好的，每次都能达到3个9以上，但是柱压阿，一直让我很担心。进一针，往上跑一点，虽然每次冲柱后能降一些，但是还是有上升的趋势。这对于我大批量样品而言，是很不合适的。看来用甲醇硫酸锌沉淀不太合适。尽管以前这种沉淀剂我也用过，但是那时候是Agilent的柱子，且粒径是5μm的。可能对于Waters的这一型号的柱子，用盐或者是不太完全的蛋白沉淀方法不太合适。

6）有得重新选择沉淀剂，最常用的还是甲醇和乙腈。乙腈沉淀效果好，所需的用量也相对少。但是样品在乙腈中响应就是低，峰也太宽。不行还是得用甲醇。可是问题来了，甲醇的用量大，样品的稀释倍数就多。不过甲醇沉淀，也基本能满足我500ng/mL的LLOQ的要求。但是峰形就是没有我用硫酸锌沉淀的好。

7）尝试优化峰形。考虑到甲醇硫酸锌沉淀中是有水（用来溶解硫酸锌的），可能是受到溶剂效应的影响，我就尝试着在甲醇沉淀后，上清液又加水的方法，果然，峰形变好看了，峰也瘦了，而且虽然加了水，但是峰高与不加水比基本没有下降。





8）最后我用30μL进样，LLOQ能做到200ng/mL。

4．测定预试样品，新问题出现
预试测定了100个血浆样品，检测限没有问题，但是新的问题还是出现了，发现我的标准曲线样品的干扰峰是在样品和内标中间的，但是4个受试者的血浆干扰峰均在内标峰出峰的地方。
我做标准曲线的血浆购自血站，是病毒灭活过的。但是受试者的血浆，是抽的招募健康受试者的血直接离心得到的。难道是这个差别。然后我试了实验室其他的从健康受试者身上采的的血浆做了验证，果然，干扰峰均在内标出峰的地方出峰。
这是我用买来血浆做的


这是受试者的血浆


5．重新优化色谱条件
翻阅了实验记录，还是决定先调节水相的pH值来试试，是往酸还是往碱调？发现干扰峰基本在内标快出完的时候出，所以决定还是往酸调，把它往后推。就调回了3.0，果然，两者分开了，基线分离。

并且我又可以把缓冲盐的浓度降下来了，仪器因为高盐会析出而损坏等的风险也可以降低些了。


到此，我的方法优化正式结束，加上预试后重新优化，经历了2个月的时间。现在方法学考查也已经完成。

最后，做个小结，也算对用HPLC做生物样品分析（血浆、尿、组织等）的版友介绍一下我的个人体会，供大家参考：

1 首先就是要查阅相关资料，如文献等，了解你要测化合物的性质，根据文献来选择你的初始条件。比如色谱柱、流动相、前处理方法，还有检测器等等。
2 了解液相的基本原理和基本操作，这是你做好液相、用好液相的前提。比如什么样品可以用反相、什么样品用正相系统来检测，反相系统加大有机相的比例峰会怎么变化；柱温、流动相pH值、溶剂对你的样品峰会有什么影响；遇到一些简单的仪器问题怎么处理、一些仪器参数是什么意思、对你的样品峰有什么影响等等，当然这些是慢慢学习的过程，学的越多，你会发现你建立方法用的时间越短、走的弯路越少。当然，我也在慢慢的学习中。
3 知道各种前处理方法及其优缺点，比如沉淀剂的种类、加入的比例，适合的化合物性质。常用的提取溶剂有哪些，适合提取的化合物的极性等。
4 要预先估计你所需要的LLOQ，根据这个LLOQ来优化你的色谱条件。比如灵敏度足够，可以用沉淀，不够可以用提取，提取浓缩的比例根据LLOQ来定。当然还可以其他的辅助手段，比如加大进样量、用梯度洗脱的方式等等。
5 做液相可能最头疼的就是干扰，用紫外检测器特别是在低的检测波长段，可以说是杂草丛生，所以一般分析时间都比较长。改用提取后，可能会好些。如果可以，宁愿牺牲一些灵敏度而选择相对高一些的检测波长。荧光检测，干扰就很少。多试不同来源的空白基质，确保没有干扰。有条件，也像我这样，买来的空白血浆和受试者的空白最好也试一下，以免不同（这样的情况非常非常少见）。

先写这么多，比较乱，有空再来上点图谱。其中有写的不当的地方，请大家批评指正。

感谢楼主给大家介绍了建立一个新的分析方法的全过程，而且很详细，值得很多人学习啊

很详细啊，好好学习下

能弄到word上直接下载就更好了，

楼主辛苦了，学习了，真的很感谢。以后这方面经验多多交流。