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第1楼2009/11/27
由谱图可以看出,分析二甲基苯氧乙酸时流动相中加酸调节pH至2.49改善了峰形,加入酸的作用是,一方面抑制了硅羟基的离子化,另一方面也抑制了有机酸的离子化,因而削弱了-COO-与Si-Oδ-Hδ+的相互作用,减小了拖尾。
碱性化合物中,容易发生拖尾的化合物中通常包含着-NH2、-NHR、-NR2,即伯、仲、叔三种富电荷的极性基团,它们的碱性强弱顺序为:-NH2 < -NHR < -NR2,其碱性强弱跟与N原子直接相连的基团有关,吸电子基团会削弱这种碱性,供电子基团(如烷基)则使之增强。伯氨中甲胺的碱性最弱,以它为例更具有代表性,甲胺的pKa为10.64,那么在pH< 8.64的时候它是完全呈离子态的,也就是-NH3+,那么pH在2.5~8.64时,特别是pH6.7~8.64时,因为此时带氨基的化合物和硅羟基均以离子状态-NH3+和Si-O-形式存在的,它们之间相互吸引的静电作用导致后拖,这就是为什么很多碱性化合物在pH 7.0的条件下容易产生拖尾的原因,而很多色谱柱生产商也因此以阿米替林(含-N(CH3)2,碱性比-NH2强)在pH 7.0的条件下来评价和比较不同色谱柱之间的优劣,该条件下的阿米替林的峰形越好说明封尾越好,封尾工艺成功的阻止了残余硅羟基与样品分子的接触。而在pH<2.5的条件下,也仍然后拖,是因为-NH3+足够强,即使硅羟基以分子状态存在也仍能够与Si-Oδ-Hδ+中氧原子产生吸引作用,导致峰形拖尾。当pH>12.64的时候,甲胺完全以分子状态形式存在,不会引起拖尾。所以分析有些化合物,流动相的pH需要调至强碱性条件下峰形才会变好。
3. 增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度:
流动相中加入缓冲盐,增强了流动相的离子强度,在-NH3+等极性基团和硅羟基Si-O-之间存在着许多离子的干扰,减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会,有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用,改善峰形。这种适合于碱性较弱(如氨基的N原子与强吸电子基相连),或碱性很强,但在刚性结构中,比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基,例子如高乌甲素的测定:
虽然加入了三乙胺,但加入的量非常少,200ml混合好后的溶液中,只加入了75ul滴用于调节pH的(因为不调节pH,保留时间太短,在4.2min出峰),相对于2%的浓度的量而言75ul是非常少的,几乎起不到屏蔽硅羟基的作用,因此,上图中峰形改善的原因,主要的应归功于缓冲盐的加入。
4.往流动相中加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等
基于上面的解释,既然拖尾的产生是因为-NH2、-NHR、-NR2与硅羟基发生静电作用引起的,那么阻碍它们之间静电作用的途径,应该有两种,一种是占据硅羟基这个作用位点,另一种是占据-NH2、-NHR、-NR2这个作用位点。
1)流动相中加入三乙胺
在流动相中加入三乙胺,能显著的改善峰形,消除拖尾。其作用是屏蔽硅羟基,使碱性化合物在分离的过程中减少了和硅羟基相互接触的机会,失去了导致拖尾的作用位点。三乙胺的pKa为11.09,在pH<11.09-2=9.09的条件下是以离子状态N+H(CH2CH3)3的形式存在的,因此pH在2.5~8.64 硅羟基呈Si-O-离子态的情况下,N+H(CH2CH3)3容易与Si-O-形成相对较强的静电吸引力,流动相中加入了三乙胺后,平衡柱子的过程中已经优先占据了硅羟基的作用位点,而带氨基的样品分子虽然在该pH条件下也呈离子状态-N+H3、-N+H2R或-N+HR2 ,也能与Si-O-形成相对较强的静电吸引力,但三乙胺有先占住位点的优势,使样品分子与硅羟基的作用大大减弱,缓解了拖尾的产生;同时,流动相中存在的N+H(CH2CH3)3 仍然与样品分子中的极性基团与硅羟基的相互作用产生竞争,更进一步的削弱了样品分子与硅羟基的接触机会,改善峰形。例子如:头孢噻肟钠的测定:
通常加入三乙胺的量约为2%即有显著的效果,如有需要可适当增大用量。加入三乙胺改善峰形的时候,有两点需要注意的:1)三乙胺的碱性很强,加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围,对色谱柱造成损伤,同时,pH的改变也会导致出峰时间的显著变化,为了避免保留时间变化太大而可能引起的其它问题,因此,建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值,但通常即使pH回调过也仍会引起保留时间的较大变化;2)三乙胺在210nm处有比较强的吸收,如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用,以免因加入三乙胺后本底上升,而引起峰高、峰面积下降,检测灵敏度严重降低,有些甚至看不到峰,例子如地红霉素的测定:
柏坡
第2楼2009/11/27
例子如地红霉素的测定:
第二个图中连进了两针都没有峰出现,这种现象得到了重现性。由此可见,三乙胺用于改善峰形,其使用范围是有一定限制的。
2)流动相中加入四烷基季铵盐等离子对试剂
由上可知,加入三乙胺能改善峰形是由于pH<9.09的条件下,三乙胺的状态为N+H(CH2CH3)3与硅羟基的离子态Si-O-形成相对较强的静电吸引力,占据了位点,有效的阻止了氨基与硅羟基的接触造成的次级保留效应。同样,四烷基季铵盐(如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等)在水中电离后,也形成了类似N+H(CH2CH3)3的结构N+(CH2CH2CH2CH3)4 ,这种结构也能有效的与Si-O-产生较强的静电作用,阻止氨基与硅羟基的接触,改善峰形。而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是,它在低波长范围的吸收比三乙胺弱。例子如罗红霉素的测定:
3)流动相中加入辛烷磺酸钠等离子对试剂
流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好的改善峰形,其作用机理与三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不同。三乙胺和四丁基硫酸氢铵是通过与硅羟基的作用来阻止样品分子中的氨基与硅羟基接触,而烷基磺酸盐则是通过与样品分子的作用来阻止样品分子与硅羟基的作用来改善峰形。以庚烷磺酸钠为例,庚烷磺酸钠在水中电离成SO3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 而样品分子中的几种结构的氨基则大约在pH<9的条件下形成呈离子状态-N+H3、-N+H2R或-N+HR2,显然,SO3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3能与它们形成较强的静电作用,有效的阻止了样品分子与硅羟基的作用,改善峰形,例子如盐酸丙美卡因的测定: