东风恶
第5楼2010/03/07
流动相制备
流动相A: 0.1mol/L醋酸钠(取醋酸钠13.6g,加水约800ml使溶解,用水稀释至1000ml)-乙睛(93:7),用稀醋酸调pH值至6.5,用0.45µm滤膜过滤后备用。
流动相B: 乙睛-水(80:20), 用0.45µm滤膜过滤后备用。
冲洗液:甲醇(乙睛)-水(20:80), 用0.45µm滤膜过滤后备用
流动相梯度洗脱表:
T(min) A% C%
0.01 100.0 0.0
11 93.0 7.0
13.9 88.0 12.0
14 85.0 15.0
29 66.0 34.0
32 30.0 70.0
35 0.0 100.0
42 0.0 100.0
45 100.0 0.0
55 100.0 0.0
东风恶
第6楼2010/03/07
衍生
对照品溶液制备
取Waters公司提供的氨基酸对照品浓溶液进行10倍稀释作为对照品溶液(详见9.附注);或精密称定中国药品生物制品检定所16种氨基酸对照品配制成同样浓度的对照品溶液。
供试品溶液制备
精密量取/称取供试品适量,并配制成相应浓度的溶液备用。
衍生步骤
将恒温水浴锅预热至50±1℃;
将衍生试剂从冰箱中拿出并放至室温;
精密量取上述对照品和供试品溶液1ml,置试管中,加入A溶液0.5ml,B溶液0.5ml,摇匀,在50±1℃水浴中加热45分钟,取出.加入C溶液1ml,振摇,并用孔径为0.45μm有机膜过滤,放置30分钟后,取澄清的下层液进行分析试验。
色谱条件
色谱柱:氨基酸分析柱(4.6×250mm)
流 速:1.0ml/min
柱 温:40℃
紫外检测波长:254nm
进样量:2.5μl
工作站记录时间:55min
测定
A、B通道全部用纯水排尽气泡,平衡系统。
设柱温40℃,流速1.0ml/min;
用20%甲醇(或乙腈)水溶液冲洗30分钟置换掉色谱柱保护液;
用流动相A平衡柱20min;
运行一次空白梯度(二次更好)。
进样分析:先进对照品溶液,后进样品供试液。上次样品走完与下次进样之间相隔应不超过3min。
冲洗
进样分析完毕后,关闭检测器,用20%甲醇(乙腈)水溶液代替流动相A,进水样分析,待梯度洗脱程序启动后,关闭检测器。
换100%水冲洗40min以上;
如果保存时间为3天或更少时,可用乙腈/水(80:20)冲洗20min;如果保存时间超过3天或不能确定时,用100%乙腈冲洗20min。
分别用20ml超纯水冲洗柱塞杆外部和法兰盘上小孔。
附注
Waters公司18种氨基酸对照液稀释10倍后,各氨基酸的浓度为:
Name M.W. C(mmol/L) C(mg/ml) Name M.W. C(mmol/L) C(mg/ml)
门冬氨酸 133.10 0.25 0.03328 胱氨酸 240.30 0.125 0.03004
丝氨酸 105.09 0.25 0.02627 酪氨酸 181.19 0.25 0.04530
谷氨酸 147.13 0.25 0.03678 缬氨酸 117.15 0.25 0.02929
甘氨酸 75.067 0.25 0.01877 甲硫氨酸 149.21 0.25 0.03730
组氨酸 155.15 0.25 0.03879 赖氨酸 146.19 0.25 0.03655
精氨酸 174.20 0.25 0.04355 异亮氨酸 131.17 0.25 0.03279
苏氨酸 119.12 0.25 0.02978 亮氨酸 131.17 0.25 0.03279
丙氨酸 89.093 0.25 0.02227 苯丙氨酸 165.19 0.25 0.04130
脯氨酸 115.13 0.25 0.02878 色氨酸 204.23 0.25 0.05106