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【分享】流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法
gotobio111
2010/06/02
私聊
生命科学仪器综合讨论
基本原理
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(
PS
)从细胞膜内转移到细胞膜外,使
PS
暴露在细胞膜外表面。
PS
是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使
PS
暴露在细胞膜外。
Annexin V
是一种
Ca+
依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,
Annexin V
具有易于结合到磷脂类如
PS
的特性。对
PS
有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的
PS
。
PS
转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用
Annexin V
结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
试剂与仪器
孵育缓冲液:
10mmol/L HEPES/NaOH
,
PH 7.4
,
140mmol/L NaCl
,
5mmol/L CaCl2
标记液:将
FITC- Annexin V
(宝灵曼公司产品)和
PI
加入到孵育缓冲液中,终浓度均为
1ug/ml
流式细胞仪
实验步骤
1.
细胞收集:悬浮细胞直接收集到
10ml
的离心管中,每样本细胞数为(
1~5
)×
106
,
/mL
500~1000r/min
离心
5min
,弃去培养液。
2.
用孵育缓冲液洗涤
1
次,
500~1000r/min
离心
5min
。
3.
用
100ul
的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育
10~15min
。
4. 500~1000r/min
离心
5min
沉淀细胞孵育缓冲液洗
1
次。
5.
加入荧光(
SA-FLOUS
)溶液
4
℃下孵育
20min
,避光并不时振动。
6.
流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用
488nm
,用一波长为
515nm
的通带滤器检测
FITC
荧光,另一波长大于
560nm
的滤器检测
PI
。
7.
结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如
PI
有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的
DNA
可被
PI
着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期
PI
不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(
FITC-/PI-
);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(
FITC+/PI+
);而右下象限为凋亡细胞,显现(
FITC+/PI-
)。
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