【转帖】庆大霉素和林可霉素注射液的毒理学试验研究

1 材料与方法

1．1 受试药物庆大霉素和林可霉素注射液，含庆大霉素0．08 g／mL，林可霉素0．03 g／mL，由东北农业大学动物医学院自行研制。

1．2 试验动物 昆明种小鼠，体重18～22 g；新西兰白兔，体重2．8～3．0 kg；白色豚鼠，体重280～300 g，均由哈尔滨南岗区兴旺养殖场提供，许可证号：scx2007002。

1．3 急性毒性试验(徐叔云等，2002)

1．3．1 预试验取小鼠12只随机分成3组，每组4只，雌雄各半，禁食12 h，不禁水，分别以组间剂量比值为1：0．8和1：0．6进行预试验，通过预试验初步观察小鼠的毒性反应和死亡情况，分别找出庆大霉素和林可霉素注射液对小鼠染毒的大致致死剂量范围(即死亡率0 ～100％ 的剂量范围)，确定小鼠的正式试验剂量、组数和组间剂量。

1．3．2 正式试验在室温2O℃ 的实验室中，取禁食12 h的小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组1O只。各组动物均肌肉注射给药。根据预试验的结果确定最高剂量组为7．80 mg／kg，其余各组间剂量比为(1：0．8)。给药后观察7 d，自由饮水和进食，记录各组动物给药后的症状和体征、死亡数和死亡时间，并用改良寇氏法计算半数致死量。

1．4 溶血试验

1．4．1 2 红细胞悬液的制备取新鲜家兔血10mL，置三角烧瓶中，瓶中预先放置蒸馏水冲洗干净的玻璃珠，摇匀除去纤维蛋白原，制成脱纤血液。然后将除蛋白血移入10 mI 刻度离心管内，加入生理盐水10 mL混匀，以2000 r／min离心10 min，弃去上清液，再用10 mL生理盐水冲洗，如此反复4次，直至上清液呈无色为止，按所得细胞容积，用生理盐水配制成2 红细胞混悬液，备用。

I．4．2 受试物的制备以药物的临床使用浓度用生理盐水1：3稀释成7．5 mg／kg。1．4．3 加样和温育 取试管7支，1～5号管分别加入受试药物0．1～0．5 mL和生理盐水2．4～2．0mL，第6管仅加生理盐水，不加受试药物(阴性对照)，第7管仍不加受试药物，用蒸馏水代替生理盐水(阳性对照)。将各管置于37℃水浴中保温，开始每隔15 min观察1次，1 h后每隔1 h观察1次，连续观察4 h。

1．5 血管刺激性试验取健康家兔6只，随机分为受试药物组和对照组(生理盐水)，每组3只，剂量为10 mg／kg，家兔置于兔固定箱，每日定时以无菌操作法于家兔耳缘静脉给药1次，连给5次，每次给药后24 h肉眼观察注射部位有无充血、水肿、出血、坏死。于末次给药后24 h，处死动物，剪下兔耳，并取给药部位静脉血管组织(离注射点近心端0．5、1．5、3．0 cm截取)作病理切片，经1O％甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察。病理学检查指标：静脉血管内皮细胞的完整度，有无变性、坏死改变、基底膜是否完整、管壁及管周组织的完整情况等。

1．6 肌肉刺激性试验 取健康家兔4只，雌雄各半，体重3．0～3．1 kg，将家兔固定于固定箱内，分别于一侧股四头肌内注射受试物1 mI ，另一侧相应部位同法注射等量生理盐水作为对照。给药后观察注射局部肌肉反应情况，如充血、红肿、坏死等，给药后48 h处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉的刺激反应。按表1计算相应的反应级并进行局部组织病理学检查。表1 肌肉刺激反应分级标准

1．7 皮肤刺激试验取4只家兔，雌雄各半。每只动物分笼饲养，于给药前24 h将动物脊椎两侧对称部位以手术剪剪毛后，用脱毛剂(硫化钡：淀粉：洗衣粉一3：7：1)脱毛，脱毛区面积为4 cm×6 cm，试验采用同体左右侧自身对比，左侧脱毛区涂受试物0．5 mL／次，右侧脱毛区涂空白基质0．5 mL／次，并用无刺激纱布及胶布加以固定。每只动物单笼饲养。24 h后用温水除去残留的受试物，1、24、48、72h后肉眼观察并记录涂抹部位有无红斑和水肿等情况。采用同体左右侧自身对比，对评分较高或可疑的受试动物处死1只，以10 福尔马林溶液固定，常规制作切片，HE染色，光学显微镜进行病理组织学检查，并根据皮肤刺激性强度评价标准和病理学检查判定结果。

皮肤刺激性反应评分标准：① 红斑：无红斑，0分；勉强可见，1分；明显可见，2分；中度到严重红斑，3分；紫红色红斑并有焦痂形成，4分；②水肿：无水肿，0分；勉强可见，1分；可见(边缘高出周围皮肤)，2分；皮肤隆起约1 mm，轮廓清楚，3分；皮肤隆起约1 mm 以上并范围扩大，4分。最高总分值为8分。皮肤刺激性强度评价标准：平均分值为0～0．49分，无刺激性；0．5～2．99分，轻度刺激性：3．0- 5．99分，中度刺激性；6．0～8．0分，强刺激性。

1．8 全身过敏性试验 取健康豚鼠18只，分为3组，即受试物组、卵蛋白阳性对照组及溶剂阴性对照组。各组动物均按无菌操作隔日分别静脉注射相应药液0．5 mL／只，共3次致敏。将各组动物分为2批，每批3只，分别于首次注射后14和21 d静脉注射相应药液(1 mL／只)攻击，于攻击后15min内，观察动物，评分标准如表2、3(袁伯俊等，1997)

表2 过敏反应评分

2 结果

2．1 急性毒性试验 高剂量组中小鼠的中毒表现是在注射后精神有些兴奋，竖毛，呼吸频率变快，1 min后开始摇晃，伴有恶心，呕吐状，共济失调，肌肉抽搐，2 min后不动，俯卧死亡。剖检结果为腿部

肌肉的血管肿大，肝脏颜色变深，其他组织均无变化。

应用改良寇氏法计算半数致死量(LD 。)，最大剂量组的对数值：Xm=0．892，相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数i一0．097，各组的动物死亡率之和Σp一2．5，则logLD5。一Xm—i(Σp一0．5)一0．892— 0．097× (2．5— 0．5)一0．698，LD5o===4．989mL／kg，logLD5。的标准误S一0．0261，logLD5。的95％可信限一logLD5。±1．96×S一0．75～0．646，LD 。的95 可信限为5．623~4．426 mL／kg。

2．2 溶血试验 在观察时间内，1～6号管未见溶血和红细胞凝聚现象，第7管溶液呈红色透明，有溶血现象。结果表明0．1～0．5 mL庆大霉素和林可霉素注射液在4 h内对兔红细胞不产生溶血和凝聚作用。一般认为0．3 mL的注射液不产生溶血作用即可供注射用。

2．3 血管刺激性试验 肉眼观察受试药组和对照组的注射部位及周围组织，均未见充血、水肿、出血和坏死。病理检查结果表明，对照组3只兔和受试药组3只兔耳近端、远端均未见充血、水肿、炎症及变性、坏死血栓等改变。说明庆大霉素和林可霉素注射液对血管无刺激性。

2．4 肌肉刺激性试验给药后家兔健康如常，对照组部位未见异常病理改变，反应分级结果见表4。药物注射组每只兔都有轻微的充血，其范围在0．5cm×1．0 cm以下，但4块股四头肌反应级的最高与最低之差等于0，家兔4块股四头肌反应级之和小于1O，故认为供试药物的局部刺激试验符合规定。表4 肌肉刺激性反应分级结果(只)

绢别 1 2 3 4

药液

生理盐水

1 1 1 1

0 0 0 0

2．5 皮肤刺激试验 按照上述评分标准和评价标准，相当于临床用量2倍的药物停药后1、24、48、72h，庆大霉素和林可霉素注射液对家兔完整皮肤均无刺激性(表5)。病理组织学检查结果为停药后镜下均未见明显异常(图1、2)。

表5 对肤刺激性的评价(只)

2．6 全身过敏性试验 由表6可见，庆大霉素和林可霉素注射液及生理盐水组豚鼠在首次致敏后第14天及第21天静脉注射药液攻击，在观察期内均未发现不安、颤抖、搔鼻、喷噎、呼吸急促等过敏反应，所有动物均存活，没有死亡。而阳性对照组(10 卵蛋白)豚鼠于攻击后15 min内均出现明显的呼吸困难，抽搐，直至死亡。

图1 皮肤刺激试验对照组

图2 皮肤刺激试验涂药组

表6 全身过敏性试验结果

组别 级别

阴性

阳性

注射组

3 讨论

由急性毒性试验结果可知，该药的半数致死量为4．989 mL／kg，为临床剂量的15倍，说明此药很安全。肌肉注射后小鼠腿部有鼓起但很快消去，证明该药吸收很快。通过试验中对小鼠体重的测量发现，注射该药后小鼠饮食正常。溶血性是注射剂必须考察的一项安全性评价指标，但目前尚无标准的临床前体内试验方法能全面评价药物制剂的溶血反应，因此笔者选用常规的体外试管法评价庆大霉素和林可霉素注射液的溶血性，结果表明，该注射液在注射后4 h内对大耳白兔红细胞均无溶血作用。刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆炎症反应，若给药部位产生了不可逆的组织损伤则称为腐蚀性。刺激性试验是观察动物的血管、肌肉、皮肤等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。本试验结果表明，庆大霉素和林可霉素注射液对大耳白兔肌肉、耳缘静脉血管、皮肤及周围组织均无明显刺激作用。

当过敏原(包括抗原，如异种血清、微生物代谢产物等)进入机体，刺激机体产生抗体，当又有抗原进入即与抗体反应，刺激肥大细胞产生组织胺等，从而产生过敏反应。其中以皮肤过敏反应(即I型超敏反应)最为常见，而目前因无理想的Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应的动物模型，光敏性动物模型的临床意义尚不明确。所以，虽然主动全身超敏试验(AAS)对小分子物质检测的可靠性尚不确定，但仍然是致敏性试验研究中较常用的试验方法。AAS结果表明，庆大霉素和林可霉素注射液对豚鼠未见明显过敏反应。