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【原创】色谱方法建立岂无凭？——浅谈HPLC方法的建立

小丑

2010/10/11

首先感谢迪马科技提供这样一个讨论的平台。
在这里我想就HPLC方法建立的原理进行浅显的探讨。

第一天引子
当分析者接受一项色谱分析时，往往会被告知具体的操作方法或条件。如果没有现成的条件，还需要自己亲自通过实验建立方法。一项具体的方法包括：样品准备(溶剂、浓度)，色谱柱类型，色谱柱规格，流动相组成，流速，检测器及检测条件，柱温，进样体积等等。当某一方法被证实具有良好表现时，那么这个方法肯定是在正确的理论指导下建立的，我们完全可以根据正确的化学知识和分离知识在其他分析中建立出良好的方法。
事例一：苯甲酸分析
色谱柱：C18色谱柱，150*4.6 mm，5 微米；
流动相：0.2%磷酸水溶液+甲醇=40+60；
流速：1 ml/min；
检测波长：230 nm；
柱温：30 摄氏度
进样体积：10 微升；
样品溶液：以水作溶剂或流动相作溶剂。
为何选择C18？
答：苯甲酸含有苯环，化合物具有一定程度的疏水性，十八烷基固定相对该化合物具有一定程度的保留或选择性，进而使该化合物与样品溶液中的其他化合物分离；
为何以“0.2%磷酸水溶液+甲醇”作为流动相？
答：分离中，为保证化合物具有良好峰形，应务必保证化合物以单一形式存在，苯甲酸上的羧基具有解离性，在水溶液中会部分解离出质子，而以阴离子和分子形式存在。只有当某一形式占总量的99%以上时，苯甲酸的峰形才能比较完美。根据化合物的解离平衡，只有当流动相的pH值大于化合物的pKa+2或小于pKa-2时，才能满足上述条件。苯甲酸的pKa约为4.20，所以流动相的pH应大于6.2或小于2.2，大于6.2时，苯甲酸以阴离子形式存在，小于2.2时以分子形式存在。事例中的0.2%磷酸水溶液+甲醇则保证了苯甲酸不解离，该方法为离子抑制法。当然若选择pH=7的中性缓冲液+甲醇，苯甲酸以阴离子形式存在，也能实现较好峰形。正所谓“条条大道通罗马”，只要选对路就行了。
为什么选择水或流动相做样品溶剂？
答：流动相是最好的样品溶剂，这很容易理解，只要有允许，就应用流动相溶解样品；对于反相色谱，水溶液进样也是合适的，但进样体积不应过大；务必了解，样品溶剂的洗脱强度不应明显高于流动相洗脱强度，比如流动相为10%甲醇水，样品溶剂为醇甲醇，这会造成色谱峰分叉。
检测器和检测条件选择
答：根据化合物的吸收特性和分析要求选择，紫外-可见是最常用的检测器，当化合物具有紫外-可见吸收时应尽量选择该检测器，检测波长应通过紫外-可见扫描获得。若紫外-可见吸收较弱，可选择其他检测器，比如示差、蒸发光闪射、质谱等等。

今天先讲到这儿，随后会及时更新，以后的更新片头为“第某天”。欢迎大家参与讨论。
温馨提示：请不要发灌水帖，也不要发布不确定的知识。谢谢合作。

分
该帖子已被版主-Eda加5积分，加2经验;加分理由:感谢发起有意义的话题

相关话题

往往外

第1楼2010/10/11

应助达人

文中有一句？
流动相是最好的样品溶剂？？？

难道样品的溶剂决定流动相？

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小丑

第2楼2010/10/11

建立出的合适的方法后，您就可以用该方法的流动相去溶解样品，然后进样分析。也许是我没说清楚造成了误解，谢谢您的提醒。
寒冰(cxm2009) 发表:文中有一句？
流动相是最好的样品溶剂？？？

难道样品的溶剂决定流动相？

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sungw

第3楼2010/10/12

LZ写的很详细，希望能继续看到后面的内容！谢谢！

0

yyyyy0738

第4楼2010/10/12

很好啊经典！期待更新

0

dahua1981

第5楼2010/10/12

应助达人

写的很好，学习了

0

271314

第6楼2010/10/12

能再深入些就更好了

0

star_05240721

第7楼2010/10/12

期待更新

0

geebzbz

第8楼2010/10/12

顶！楼主写的很好，也提供了一个很好的交流机会。谢谢了！
我问大家一个简单的问题哈：我目前正在分离细菌发酵产物中的活性物质，用Agilent1200，对于样品的检测波长我怎么确定啊？样品来源是乙酸乙酯萃取后，用水溶解，这个水溶液也做过紫外扫描，可是在190到300这段里边很多很强的吸收峰；如果稀释的话，随着稀释倍数的增加，峰个数不断减少，峰对应的最大波长也不断地蓝移，这样的情况下，我该怎样去确定一个或者几个波长检测的波长呢？因为DAD可同时检测5个波长。谢谢指导了！

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xue2009

第9楼2010/10/12

尽量在你的活性物质都具有较大吸光度的波长下测
geebzbz(geebzbz) 发表:顶！楼主写的很好，也提供了一个很好的交流机会。谢谢了！
我问大家一个简单的问题哈：我目前正在分离细菌发酵产物中的活性物质，用Agilent1200，对于样品的检测波长我怎么确定啊？样品来源是乙酸乙酯萃取后，用水溶解，这个水溶液也做过紫外扫描，可是在190到300这段里边很多很强的吸收峰；如果稀释的话，随着稀释倍数的增加，峰个数不断减少，峰对应的最大波长也不断地蓝移，这样的情况下，我该怎样去确定一个或者几个波长检测的波长呢？因为DAD可同时检测5个波长。谢谢指导了！

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小丑

第10楼2010/10/13

严格来说，您分析的样品应为发酵产物乙酸乙酯萃取物，样品中化合物的种类复杂并且有待于定性。此时，本人建议您这样做：二极管阵列检测，采集数据后，在230 nm-400 nm波长范围内，每隔10 nm提取一张色谱图；如果样品溶液有颜色，应在230 nm-800 nm范围内每隔10 nm提取一张色谱图。“DAD同时检测5个波长”，这是采集数据的情况下可同时监测5个波长，实际上在数据后处理部分，您想要哪个波长下的色谱图都可以。还需要在熟悉一下仪器操作啊。
geebzbz(geebzbz) 发表:顶！楼主写的很好，也提供了一个很好的交流机会。谢谢了！
我问大家一个简单的问题哈：我目前正在分离细菌发酵产物中的活性物质，用Agilent1200，对于样品的检测波长我怎么确定啊？样品来源是乙酸乙酯萃取后，用水溶解，这个水溶液也做过紫外扫描，可是在190到300这段里边很多很强的吸收峰；如果稀释的话，随着稀释倍数的增加，峰个数不断减少，峰对应的最大波长也不断地蓝移，这样的情况下，我该怎样去确定一个或者几个波长检测的波长呢？因为DAD可同时检测5个波长。谢谢指导了！

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