【资料】生物化学实验基本技术：萃取技术

临界点的概念可用临界温度和临界压力来解释。临界温度是指高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化；临界压力是指在临界温度下，液化气体所需的压力。而超临界流体则是处在高于其临界点的温度和压力条件下的流体(气体或液体)，在这一区域内，其具有较大的可压缩性及较高的密度，同时具有气体和液体的双重性质。
由于流体对溶质的溶解力随密度的增大而增大，在压力恒定条件下，随温度的升高而升高，因此，超临界流体对溶质有非常高的溶解性和萃取能力。同时，在超临界范围内，在保持温度恒定的条件下，可通过调节压力来控制超临界流体的萃取能力或保持密度不变改变温度来提高其萃取能力。溶剂和溶质之间的分离(即萃取物的释放)可通过超临界相的等温减压膨胀来实现，因为在低压下溶质的溶解度是非常小的。
超临界萃取的实际操作范围即涉及通过调节压力或温度改变溶剂密度从而改变溶剂的萃取能力。
表2－1 超临界流体特性的变化范围

超临界流体萃取的基本过程

图2－2 超临界流体萃取流程图
超临界流体在萃取器中，从基质中萃取化合物A，流体的溶解能力受密度控制。流体相通过节流阀膨胀使CO₂密度减小，萃取物A 从流体相中分离出来并收集在分离器中，而溶剂再经过压缩机增压和热交换器降(升)温后，循环使用。从图2－2可见，过程基本上是由萃取与分离两个主要阶段组成。
从热力学和动力学角度考虑，可将超临界分离过程分为下面三种：
(1)依靠压力变化的萃取分离法(等提法成绝热法)。在一定温度下，使超临界流体和溶质减压，经膨胀后分离，溶质由分离器下部取出，气体经压缩机返回萃取器循环使用。
(2)依靠温度变化的萃取分离法(等压法)。经加热、升温使气体和溶质分离，从分离器下部取出萃取物，气体经冷却、压缩后返回萃取器循环使用。
(3)用吸附剂进行的萃取分离法(吸附法)。在分离器中，经萃取出的溶质被吸附剂吸附，气体经压缩后返回萃取器循环使用。

超临界流体萃取的优缺点
超临界流体萃取对生物产品的分离具有极大的诱惑力，其原因是它存在有许多特点：
(1)超临界萃取同时具有液相萃取和精馏的特点。超临界萃取过程是由两种因素，即被分离物质挥发度之间的差异和它们分子间亲和力的大小不同，同时发生作用而产生相际分离效果的。如酒花的萃取，可控制在不同的柱高，排放出不同挥发度的产物；超临界CO2对咖啡因和芳香素具有不同的选择性。
(2)超临界流体萃取的独特的优点是它的萃取能力取决于流体的密度，而密度很容易通过调节温度和压力来加以控制。超临界流体萃取中的溶剂回收很简便，并能大大节省能源。被萃取物可通过等温减压或等压升温的办法与萃取剂分离，而萃取剂只需重新压缩便可循环使用。
(3)超临界流体萃取工艺可以不在高温下操作，因此特别适合于热稳定性较差的物质。同时产品中无其他物质残留。
(4)超临界流体萃取的操作压力可跟据分离对象选择适当的萃取剂或添加夹带剂来控制，以避免高压带来的影响。
从上可见．超临界流体萃取是一项具有特殊优势的分离技术并特别适用于提取或精制热敏性和易氧化的物质，如医药品和食品等。
超临界流体萃取的主要缺点是由于高压带来的高昂设备投资和维护费用，所以目前应用面还不宽，但是对于高经济价值的产品以及精馏和液相萃取操作不好的情况，还是应该考虑使用超临界流体萃取工艺。并且随着选用压力的降低，节能和环境治理的要求提高，以及对超临界流体性质及其混合物相平衡热力学的深入研究，超临界萃取工艺会得到更为广泛的应用。

4.反胶束萃取法
随着基因工程和细胞工程的发展，传统的分离方法(如溶剂萃取技术)已显示出分离的局限性，例如难以应用于蛋白质的提取和分离。原因主要有两个：一是被分离对象—蛋白质等在40～50℃便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的生化物质分离方法已成为当务之急。反胶束萃取法就是在这一背景下发展起来的一种新型分离技术。反胶束萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都高等突出的优点。此外，反胶束萃取还有可解决外源蛋白的降解，即蛋白质(脑内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且出于构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。可见，反胶束萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径。
反胶束溶液形成的条件和特性
反波束溶液是透明的、热力学稳定的系统。反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以表面活性剂是反胶束溶液形成的关键。
表而活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶束。常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见表2－2。
表2－2 常用的表面活性剂及相应的有机溶剂

在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT，其化学名为丁二酸-2-乙基已基酯磺酸钠，结构式见图2－3。这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小，形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。

将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束。

在胶束中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外与水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心，在此核心可以溶解非极性物质。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度 (CMC)，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。正反胶束见图2－4。

在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此极性核。

由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况见图2—5。

反胶束萃取蛋白质的基本原理
对一个由水、表面活性剂和非极性有机溶剂构成的三元系统，存在有多种共存相，用三元相图表示，见图2—6。

图2－6 水—AOT—异辛烷系统相图

从图2—6可知，能用于蛋白质分离的仅是位于底部的两相区，在此区内的三元混合物分为平衡的两相：一相是含有极少量有机溶剂和表面活性剂的水相；另一相是作为萃取剂的反胶束溶液。这共存的两相组成，用细线(在图2—6中虚线)相连。

这一体系的物理化学性质非常适合于萃取操作，因为界面张力在0.1~2mN/m 范围内，密度差为10％~20％，反胶束溶液粘度适中，大约为lmPa·s 这一数量级。

蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏观两相(有机相和水相)界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束扩散进入有机相中，从而实现了蛋白质的萃取，见图2－7。

图2－7 反胶束萃取蛋白质的示意图
改变水相条件(如pH 值和离子种类及其强度等)又可使蛋白质由有机相重新返回水相实现反萃取过程。
蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包括：表面活性剂与蛋白质的静电作用力和位阻效应。影响反胶束萃取蛋白质的主要因素为蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小等。所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。
只要通过对这些因素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋白质萃取率，从而达到分离纯化的目的。

反胶束萃取蛋白质的应用
反胶束萃取蛋白质的应用范围较广，主要有分离蛋白质混合物，浓缩淀粉酶，从发酵液中提取胞外酶，直接提取胞内酶，反胶束萃取用于蛋白质复性等。

5.双水相分离技术
双水相分离技术是近十多年来国际上研究较为活跃的生物工程下游技术。其原理是，在聚合物—盐或聚合物—聚合物系统混合时，会出现两个不相混溶的水相，两种高聚物如聚乙二醇/葡聚糖或聚乙二醇/磷酸盐能形成互不相溶的两水相，如图2－8。利用生物大分子在两种水相之间的分配比例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。

表2－4和表2－5列出了一系列高聚物与高聚物、高聚物与相对低分子质量化合物之间形成的双水相系统。两种高聚物之间形成的双水相系统并不一定是液相，其中一相可以或多或少地成固体或凝胶状，如PEG 的相对分子质量小于1000时，葡聚糖可形成固态凝胶相。
表2－4 高聚物与高聚物双水相组成

表2－5 高聚物与相对低分子质量化合物之间形成的双水相系统

在双水相萃取系统中，悬浮粒子与其周围物质具有复杂的相互作用，如氢键、离子键、疏水作用等，同时还包括一些其他较弱的作用力，很难预计哪一种作用占优势。但分配系统由多种因素决定，如粒子大小、疏水性、表面电荷、粒子或大分子的构象等，这些因素微小的变化可导致分配系数较大的变化，因而双水相萃取有较好的选择性。
以聚乙二醇—葡聚糖双水相系统为例，一些影响双水相萃取的主要因素有：①成相高聚物浓度的界面张力；②)成相高聚物的相对分子质量；③电化学分配；④疏水反应；⑤生物亲和分配；⑥温度
及其他因素。
双水相萃取法的特点是将传统的离心、沉淀等液—固分离转化为液—液分离，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍。双水相系统平衡时间短，含水量高，界面张力低，为生物活性物质提供了温和的分离环境，能够保留产物的活性，因此可应用于蛋白质、酶、核酸、人生长激素、干扰素等的分离纯化，与传统的过滤法和离心法相比，双水相萃取操作简便、经济省时，易于放大，无论在收率还是成本上都要优越得多。

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