去年冬天
第1楼2011/04/22
(3)代码:B4234-25
(4)成分:
1)2.84×10²M的巴比妥钠 (sodium barbital)
2)1.25×10¹M 的氯化钠 (sodium chloride)
3) PH 7.35±0.1
3. 清洗液(Cleaning)
2%次氯酸钠溶液(自配)
(二)配套品:
1.标准血浆(Standard Human Plasma)
(1) 商标:德灵(DADE BEHRING)
(2) 代码:No. ORKL
2.校准质控血浆(Ci-Trol®)
(1) 商标:德灵(DADE BEHRING)
(2) 代码:Level 1, B4244-10
Level 2, B4244-20
Level 3, B4244-30
3.质控血浆(Control Plasma)
(1) 商标:太平洋(Pacific Hemostasis)
(2) 代码及规格:Level 1 (Normal), 100595 10×1ml
Level 2 (Abnormal), 100596 10×1ml
Level 3 (Abnormal), 100597 10×1ml
三、操作步骤:
(一) 开机:开机前,先打开连机的打印机。按下机器右边的POWER按钮。开机后机器进行自检,当屏幕上边显示“Ready”时可以进行试验。
去年冬天
第2楼2011/04/22
实验原理
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
标准蛋白质溶液(mL) | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 | 4.0 |
蒸馏水(mL) | 4.0 | 3.5 | 3.0 | 2.5 | 2.0 | 1.5 | 1.0 | 0 |
蛋白质浓度 (mg/mL) | 0 | 0.125 | 0.250 | 0.375 | 0.500 | 0.625 | 0.750 | 1.00 |
A280 |
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去年冬天
第4楼2011/04/22
实验原理
去年冬天
第5楼2011/04/22
二、标准和待测蛋白质溶液
1. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清白蛋白或酪蛋白,预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量,根据其纯度配制成150μg/mL蛋白溶液
2. 待测蛋白质溶液
人血清,使用前稀释150倍。
三、器材
试管1.5×15cm(×6),试管架,移液管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒温水
浴;分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管,按下表平行操作:
试管编号 试剂处理 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
标准蛋白质溶液(mL) | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸馏水(mL) | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
Folin-酚甲试剂(mL) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
摇匀,于20—25℃放置10min | |||||||
Folin- 酚乙试剂(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
迅速摇匀,30℃(或室温20—25℃)水浴保温30min,以蒸馏水为空白, 在640nm处比色 | |||||||
A640 |
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去年冬天
第6楼2011/04/22
二、未知样品蛋白质浓度测定
取2支试管,按下表平行操作:
试管编号 试剂处理 | 空白管 ×2 | 样品管 ×2 |
血清稀释液 (mL) | 0 | 0.2 |
蒸馏水 (mL) | 1.0 | 0.8 |
Folin-酚甲试剂(mL) | 5.0 | 5.0 |
摇匀,于20—25℃放置10min | ||
Folin-酚乙试剂(mL) | 0.5 | 0.5 |
迅速摇匀,30℃(或室温20—25℃)水浴保温30min,以蒸馏水为空白,在640nm处比色 | ||
A640 |
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去年冬天
第7楼2011/04/22
实验原理
考马斯亮蓝(Coomassie BrilliantBlue)法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm变为 595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
试剂与器材
一、试剂
操作方法
一、制作标准曲线
试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
标准蛋白溶液(mL) | 0 | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 |
0.15mol/L NaCl(mL) | 0.1 | 0.09 | 0.08 | 0.07 | 0.06 | 0.05 | 0.04 |
考马斯亮蓝试剂(mL) | 5mL | ||||||
摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色 | |||||||
A595nm |
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注意事项