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【分享】琼脂糖凝胶电泳技术
去年冬天
2011/04/29
私聊
电泳仪
电泳基本原理
迁移率(或泳动度)是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度,可用下列公式计算:
U =υ/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt
U为迁移率(cm2•V-1•min-1);υ为颗粒泳动速度(cm•s-1);E 为电场强度( V•cm-1);d为颗粒泳动的距离(cm);l为滤纸有效长度(cm);V为实际电压(V);t为通电时间(s或min)。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。
1迁移率单位= 10-5 cm2•V-1•min-1在确定的条件下,某物质的迁移率为常数,是该物质的化学特征常数。 颗粒带净电荷多,直径小而接近于球形,则在电场中泳动速度快,反之则泳动速度慢。
迁移率还与分子的形状,介质粘度,颗粒所带电荷有关,迁移率与颗表面电荷成正比,与介质粘度及颗粒半径成反比。
影响琼脂糖电泳迁移的主要因素
电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗现象 温度的影响 支持物的影响
按分离原理分类:
1.区带电泳 2.移界电泳 3.等速电泳 4.聚焦电泳
按有无固体支持物分类
1. 纸上电泳 2. 醋酸纤维素膜电泳 3. 薄层电泳
4. 非凝胶性支持物区带电泳(支持物有:淀粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶)
5. 凝胶支持区带电泳(淀粉凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、琼脂糖凝胶)
影响琼脂糖电泳迁移的主要因素
DNA的大小 DNA的构象 琼脂糖浓度 缓冲液 不同构像质粒
缓冲液 TAE:乙酸盐缓冲液 TBE:硼酸盐缓冲液 TPE:磷酸盐缓冲液
实验操作
1. 用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住,形成一个胶模并水平放置。
2. 按水平板的长×宽×0.5cm胶厚,量取0.5×TBE,并按0.7%的浓度称取agarose琼脂糖,在微波炉或电炉上加热至全熔(清澈透明)。
3. 等凝胶温度降至大约50-60以下时,加入1 mg/L溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5ug/mL ;摇匀并轻快地倒入水平板中,除掉气泡,插入梳子。
4. 凝固后,将梳子轻轻拔出。
5.去掉胶带,将水平板放入加有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中,并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。
6.在parafilm膜上依次加: ddH2O 6ul,上样Buffer 2ul ,DNA 4ul 分别混匀后点样,记录点样次序。
7. 在水平板两边的点样孔中分别加入6 μ l的λΔΝΑ/EcoRI+HindIII marker。
8. 盖好电泳槽盖子,选择适当的电泳电压(≤5V/cm)及电泳方向(DNA阴极阳极),开始电泳。
9. 当色素接近胶的先端,停止电泳,样品在紫外灯下观察、成像
℃
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