LCMS方法开发的个人愚见

xue2009

2011/11/29

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本人对LCMS方法开发的一些愚见，希望对大家有帮助。
LC/MS/MS方法的开发

一、LC方法的建立

一般针对反相色谱而言，因为进入MS分析需要挥发性的溶剂，所以LC的流动相也只能用挥发性的溶剂，最常用流动相有机相为甲醇和乙腈；

对于一个确定的目标物来说，首先应仔细分析它的分子结构式（这一点最为关键）以确定其分子极性大小，一般多羟基，羧基，氨基等等这些物质的极性都比较大，在普通C18柱难于保留，因此在分离时需得考虑用其它的柱子或者在流动相下功夫，而改变流动相无疑是最简单和成本最低的思路。一般而言，流动相主要从pH值和缓冲盐种类这两个方面入手,在建立一个LC./MS/MS方法时流动相最好加缓冲盐，可以起到增强离子化和雾化的作用，其中钠盐和铵盐是比较关键的两种缓冲盐(一般推荐用乙酸钠和乙酸铵)。一般加入钠盐均会得到较好的[M+Na]⁺信号。另外如果目标物含有较多的芳香环，那么就不得不考虑目标物的疏水性，一般含有较多芳香环的目标物极性都不会很大，所以疏水性和畸形的共同作用使得目标物在C18柱上就有较好的保留。总之“相似相溶”原理在这个过程中起到很大的增强保留的作用。

分析目标物的结构式还有一个极大的好处是：可以初步判断MS分析时采用哪种离子化方式所得的MS信号会比较高，对于ESI来说，它的实质是要让目标物先能带上电荷，然后再雾化脱去溶剂(类似于CE只能分析带电的物质，正负离子能分开并且聚焦的实质就是加高电压时正负离子发生电泳现象进而能分离开来)，一般比较适合用来分析极性较大的化合物，尤其适合分析多羟基，羧基和生物碱类物质，并且在这种情况下，目标组分即使在LC分离的不好也没有很大关系，因为对于目标物的定性定量可以在MS上选择提取模式(TIC)来排除其他物质的干扰；对于极性较小的物质(例如多芳香环或者甲氧基较多的基团)，ESI不能得到较好的MS信号，需要用APCI源来进行离子化，APCI类似于EI源，它的实质是让LC中流动相携带的目标组分先脱除溶剂，然后借助一个电晕针对空气的电离，使得目标组分进而能带上电荷，一般使得目标组分都是带上的是单电荷离子。由于APCI源适合分离极性较小的目标物，所以它非常适合正相色谱-质谱联用(NP-HPLC/APCI/MS)

关于LC方法的建立，对于多数方法来说都要进行梯度洗脱分析。一般是先设置一段等度程序(低有机相比例)，以便于去除因极性较大而在柱子上保留较差的杂质组分，然后再切换到梯度程序。这里为了使杂质在后面MS分析中尽量不对目标组分产生干扰，所以LC条件尽量把目标峰和杂质峰分开，设定LC程序的原则是：利用“三倍规则”和“梯度规则”共同来确定。“三倍规则”即为：流动相中的有机溶剂每增加10%，则目标物的保留因子减小三倍左右，反之亦然；“梯度规则”即为在进行一个等度分析时，从第一个峰的出现保留时间为t1，最后一个峰的保留时间为t2，如果(t2- t1)/t2的比值大于0.25，则需要走梯度程序，反之则不需要进行梯度洗脱。对于一个梯度程序的设定，通常的做法是先在LC上走一个高比例的有机相进行判断，得到目标组分大致的保留时间，这样以便于调节梯度的程序。对于保留时间而言，如果走等度程序一般建议控制在10 min以内，如果走梯度程序一般建议控制在30 min左右(建议一定要理解梯度洗脱的原理，其实质也就是保证各目标组分以尽量低的平均保留因子出峰，因为保留时间只跟目标物的平均保留因子有关，这样可以减小峰展宽，增大各目标组分的灵敏度)。

二、 MS方法的建立

对于大部分人来说，LC/MS/MS只需要会找分子离子峰和二级碎片离子峰就够了，在建立一个完整方法的过程中，质谱中有如下几个参数是要重点调节的。

首先是离子化模式，这个就看分子带电情况。一般有机酸选择负模式，生物碱选择正模式，对于两性化合物来说，如果流动相的pH值在其等电点以下，用正模式离子化方式，反之则用负模式；

其次是雾化气(干燥气)流速和温度，一般LC/MS/MS使用的雾化气为高纯氮气(不需要用高纯氦气，因为ESI是软电离技术，高纯氮气的惰性已经足够)，一般是雾化气流速越高，流动相携带的目标组分被吹扫得越彻底，但这样目标离子损失得也会越大，所以兼顾两者需要合理确定干燥气流速；干燥气温度，太高则热不稳定物质在此过程中会发生分解，太低不能达到干燥目的，一般对环境样品干燥器温度设置为300-350 ^oC 都是可以的，对于生物样品像蛋白质，氨基酸多肽等温度要低一些，防止过高的问题，导致变性分解而不能准确分析；

流动相：对于ESI-MS来说，LC的流动相流速可以尽量低(0.5 ml/mL-1.0 mL/min)，一般在较低的流速下能保证目标物的充分离子化，获得较高的MS信号，进而获得较高的灵敏度；

标样浓度：一般而言，优化条件时一般用1 ppm的标样进样1-10 μL来优化就足够了；浓度太低不能得到较好的信号，浓度太高容易形成二聚体甚至多聚体信号，这样难于判断MS的峰信号；

质谱中还有一个比较关键的参数就是锥孔电压，其调节的原则是锥孔电压越高(一般70 V的锥孔电压已经很高)得到分子离子峰的信号会越差，碎片离子峰会比较多，而且信号会比较高；反之锥孔电压低有利于获得分子离子峰的信号(一般可以将锥孔电压设置到50 V以下)。

另外离子扫描范围的调节对信号灵敏度也会有较大的影响，比如目标离子的质荷比为300，那么在做全扫描是可以设置扫描范围为50-350，尽量不要把范围设置的过宽，这样对灵敏度会有很大的影响。

在LC-MS分析时，色谱流动相用甲醇或者乙腈可能会带来不同的选择性，目前解释的原因是甲醇是质子性溶剂，而乙腈是非质子性溶剂，所以在实验过程中可以考察这两种有机相，有可能带来意想不到的选择性。

事实上要做好一个LC/MS/MS的方法，最重要的步骤要放在前处理上，其中目前运用最广泛的两种方法是SPE和QuEChERS，其中QuEChERS尤其对蔬菜和水果中的目标组分有较好的前处理效果。建议在遇到实际细节问题时，可以了解下这种方法的处理原则。

对于仪器而言，每次开机做LC/MS时记得一定要调谐，如果发现质谱的响应信号变差，也可以考虑调谐，所以调谐是一个很好的获得较好质谱信号的手段。

另外有关于质谱离子的质荷比，除了加氢或者加钠外，还有丢失中性碎片和自由基这两种方式，比如[M-H₂O+H]⁺就属于丢失了中性碎片而形成的离子，而[M-CH₃O+H]⁺ 就属于丢失了自由基碎片而形成的离子，这两种碎裂方式对于ESI判断质谱信号的归属很有帮助；还有一种可能就是[M-CH₃O]⁺，它的意思是：目标离子在丢失了自由基碎片后，其剩下的母核失去了一个电子，因而能直接带上正电荷，不需要再加氢带上电荷。这些对于分析别人文献上各个质荷比离子的归属很有帮助。

另外对于一些特定的物质，在ESI上不会有较好的信号，所以得考虑用APCI来进行分析，所以还是那点，做一个LC/MS/MS方法最重要的还是分析目标物的分子结构式以及理化性质，对于某些物质来说，可以尝试调节样品的pH值(用缓冲液进行调节)来获得较好的效果，这也是很关键的。比如8-OHdG，它就需要把样品调节到酸性条件下(以便于其分子结构的N更容易结合质子而带上电荷)才能得到较好的质谱信号。