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畅想2012，带你解析HPLC---方法论证

xiongbb

2012/01/02

工作过程中涉及到色谱的一部分，包含固相萃取、hplc、制备色谱。平心而论我更喜欢做的是hplc，但是公司很多人都只知道我会一点点spe，，2012打算写一些关于hplc方面的知识，但是只做了1年的时间，把自己曾经看过的知识，分享一下而已。有不对的地方，可以指出。

开了个头，大元旦的丢了手机，先去采购去，回来写。

新手机入手咯，嘿嘿，来写东西，其实是之前看书，学到的一些东西，一方面拿来分享，一方面加深一下我的印象，其中如果有实际例子，我会写进去。

开始学习hplc的时候，感觉使目标物分离分析就完事了，后来深入了解才晓得这只是工作完成的第一步，一种方法能够在其它实验室长期使用的完善方法还需要很多工作，如果这些方法应用在产品或者工艺中，还需要一些官方的认证，例如食品药品管理局等。

1、准确度：测定值与真实值的接近程度。理想的测定值与真值完全一致。一般用回收实验表示准确度，但是准确度的确定方式有三种：
a 与参比标准品比较；

对于被测物，样品基质不复杂的情况，用直接与标准品对比确定准确度的技术较好。（标准品厂家我就不介绍了，哈哈）当然，买了标准品也不是就合格的，可以采用一些方法去校正，元素分析、质谱、核磁等；使用标准品进行分析的时候，也可以采用hplc、gc、tlc等去确定标准品是否纯净。

值得注意的是，确定hplc准确度，需要3个以上的浓度，每个浓度还需要3个以上的平行样；

b回收测定掺入空白基质中的被测物；

如果使用hplc测定复杂基质中的目标物，使用测定掺入空白的标准品的回收率方法比较方便。由于基质中的其它组分可能干扰分离、检测被测物的准确定量，必须基质中的其它组分的潜在影响。
通过与已知的加入量比较来确定每种含量的回收率。定量分析目标物时，掺入量一般为正常分析中被测物期望含量的50 75 100%，各含量样品至少重复测试3次。
例如，测试农作物中的农药残留，基质为未使用农药的农作物。

c被测物的标准品加入法；

标准品加入法是将不同（但已知）量的目标物掺入已含一些（未知）目标物的基质中。然后通过数学计算得出原样品中目标物的浓度。这种方法特别适合基质中必须含有一定目标物的样品，例如，分析血样中胰岛素。

2、精密度

定义：当重复使用该操作步骤对一均匀样品进行多次抽样测定时，各次测定结果间的一致程度。精密度分为三种类型：重复性、中间精密度、重现性。

--------------------------------------------------------------回头写-------------------------------------------------------------------------------------------、

重复性为一种方法在相同操作条件下短时间内的精密度。其中一个方面为仪器精密度。重复进样分析同一均匀样品，并平均峰面积，算rsd。另一个方面为分析内精密度，包括同一分析人员在同一条件下，对不同时期，同样样品多次测定。

中间精密度指在同一实验室内多次使用同一方法，测定结果的一致性。例如不同日期、仪器等等。

重现性检验实验室间的精密度，往往在协作研究或方法移植实验室中进行测定。

3、线性

方法的线性是衡量响应值与浓度的校正曲线近似为一条直线的程度。这个没啥好说的，做过分析的，都懂。值得提及的是，现在有很多移液工作站，都还挺好用的。

4、范围

方法的范围就是指分析方法有足够的准确度、精密度和线性的最高和最低浓度。方法的范围可以是不连续的范围。浓度范围取决于方法的类型和用途。

5、检测限和定量限

检测限：被测物可测定响应信号的最小量。取决于信噪比，一般为3倍。

定量限：响应值能准确定量的被测物的最小浓度。一般为信噪比10倍。

lod和loq受分离条件的影响：色谱柱、试剂、仪器等都影响信噪比。

6、专属性

专属性是大多数分析方法中的最重要指标，体现了在其它干扰物存在的条件下，检测目标物的能力。

在方法论证实验中能使用许多技术，以增加方法专属性的可信度。

a 掺入已知干扰物；

顾名思义，在样品中加入少量已知的干扰物、降解产物或其它杂质，以确定所加入的物质与被测物良好分离。

b 样品降解研究；
c 峰收集后，在用其它技术对其分析；

通过收集被测物峰，在进行分析。可以选用质谱、核磁等。全波长扫描也可行。

d 专用在线检测，如质谱、全波长扫描等；
e 使用另一种色谱分离模式；

例如才用正反相、tlc、gc等方法进行对目标物分析。看是否为单一峰。

f 改变hplc方法的条件（溶剂、梯度）；

改变原来hplc方法的条件，使重叠的峰分开，如果没有新峰出现就代表化合物为单一。可以尝试多次改变条件。

7、普适性

包括不同的分析人员、实验室、色谱柱、仪器、化学试剂等因素，在实际应用条件下运行时，其结果重现性良好。

8、稳定性

建立hplc方法时使用的样品、标准品、试剂等在一定时间内（根据需要确定）必须稳定。这个地方值得说个例子，之前我们在做实验的时候发现流动相用的某品牌蒸馏水出现问题，导致实验分离度差，后来更换了另一个品牌的水得到很好的效果。这个地方说的是某品牌的水一致性较差。导致方法不稳定。

温度值得注意的关键点。仪器必备柱温箱。

流动相保存也需要注意，特别含有thf的流动相。缓冲盐也存在这个问题。

色谱柱的稳定性。建议选择正规厂家的色谱柱。售后服务比较好的。平行性比较好的。能独立生产硅胶的厂家能很好的保持色谱柱的稳定性。

其中还包含强健性，不是很懂，就不多介绍了。有问题可以跟帖或者发消息给我，我会尽可能回答大家！！

xiongbb

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tangtang

第1楼2012/01/02

看来是大制作啊。

丢了手机是很烦的，所有的电话都要重新输入。

0

zjzy

第2楼2012/01/02

我还是更喜欢spe，可能是hplc一直在做的原因吧

0

xiongbb

第3楼2012/01/02

咱俩换换吧
zjzy(zjzy) 发表:我还是更喜欢spe，可能是hplc一直在做的原因吧

0

imtoxiner

第4楼2012/01/02

跟我换吧，我也是做液相的
xiongbb(xiongbb) 发表:咱俩换换吧

0

yuduoling

第5楼2012/01/03

期待大作。

0

yuduoling

第6楼2012/01/03

楼主元旦换手机，也算辞旧迎新
xiongbb(xiongbb) 发表:工作过程中涉及到色谱的一部分，包含固相萃取、hplc、制备色谱。平心而论我更喜欢做的是hplc，但是公司很多人都只知道我会一点点spe，，2012打算写一些关于hplc方面的知识，但是只做了1年的时间，把自己曾经看过的知识，分享一下而已。有不对的地方，可以指出。

开了个头，大元旦的丢了手机，先去采购去，回来写。

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13142100

第7楼2012/01/04

占个座，来学习的，等更新

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xiongbb

第8楼2012/01/04

更新完毕，可以看了，写的比较简单
13142100(13142100) 发表:占个座，来学习的，等更新

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双面娃娃

第9楼2012/01/04

貌似简单了一些，不过是不错的总结～谢谢LZ

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jhsdbarry

第10楼2012/01/04

里面有些句子不通顺（提个小小的意见），但感谢楼主，很受益。

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