黄曲霉毒素ELISA试剂盒的几个疑问？

补充一下：最最后一个问题就是想问下我们做出来的结果必须用你们的软件进行分析么？能用EXCEL表格来分析计算出结果么？

这么大篇幅的问题，贴主辛苦了，问题很多，很好，得慢慢连载回答喽，呵呵，以下均为个人看法，不对拍砖：

1、不会对结果产生影响，抗原抗体是一一对应的，类似于分子印迹，一个结构对应一个；

2、您说的这个情况确实很对，配好的标曲溶液确实会减轻很多的工作量，但是从另一方面来说是不是也增加了成本呢？就像免疫亲和柱层析的时候，很多都会用上吐温PBS缓冲液，很多国外的企业就把这些缓冲液做成了成品卖，但是，实际上在实验室自己配的话可以降低很多的花销的。这个问题的话算是个有利弊吧。不是太懂这个标曲范围的意思，是不是类似于线性范围，大了有大的好处，可以涵盖含量不同的样品，小了也可能会更准确一些？大家一起讨论讨论

呵呵，比较晚了哦，未完待续……

M1试剂盒检测所使用的一抗是M1的兔抗因此不能与B1反应，不会因为这对结果产生影响的

我来接着回答啊！

1.首先是我想问下如果样品中有B1或者M2，用M1试剂盒检测M1，会对结果有影响么？
不会有影响。已经有版友回答了。

2.第二点是我们的标曲范围为什么是这么这么个范围？
我也用过美国的一个牌子，他们的标曲范围就很窄，而且上限很低，他们的单位都是ppt级别的～而且他们的标曲都是配好的，拿来我就不用再自己配了，这样会减少很多工作量，我也打电话问过艾杰尔的客服了，听说你们已经针对这个问题做了改进了，以后的试剂盒也是搭配已经配好的标曲溶液了。
标准曲线的范围是和我们的产品配套的，是合理的范围。而且也是在使用中得到验证的，不会有任何问题。2012年的产品也是配备好了的标准溶液的。而且价格木有变化啊！

3.第三点是我想问下，这个每一步加入的各个溶液都具体是什么成分，在整个过程中起什么作用的？比如：酶试剂、抗试剂、底物液A、底物液B以及洗板液还有那些标准品和样品稀释液～～我不想只会操作而什么都不懂，所以想来这里请教一下各位高手～谢谢了
这个需要到百度去搜索下相关的资料，ELISA试剂盒，但原理上有不些小不同，我们的属于竞争法。后面我会附一些参考资料，如果有不清楚可以电话给我们的。

4.第四点我想问下有些样品要前处理，有些就直接可以加样了，那为什么要前处理，如果不前处理会对结果有很大的影响吗？我只是想减少工作量而已～
有些样品前处理是必须的。复杂的基质会影响测定结果的，有些不用处理，是指比较干净的样品，比如纯牛奶。厂家开发产品，是会想到客户的工作量的，但是，我们终极的目的不是减少工作量，而是要一个准确的结果，所以，版主辛苦了！

5.最后一点就是想问下我做的每一次操作都会对结果有很大影响么？比如说加入的酶试剂的量的误差或者底物液的量的误差或者洗板的效果或者最后终止液加入后的混匀的时间的差别都有可能造成误差。如果都有影响，那我就想问下你们靠的什么技术或其他什么来保证我们的检测结果准确可靠，因为毕竟步骤挺多嘛～因为我每一次做标曲和回收率和检测结果都很好，所以我就觉得很好奇～
这是个good questions！相对于免疫亲和柱来讲，ELISA试剂盒的操作是繁琐了点，而且对于操作员的手法要求很高，一般新手做这个，都很难得到很好的重现，这个是产品本身的“缺陷”，所以，为啥会经常有假阳性，所以为什么需要上液相去确证，而ELISA法只是用来筛选。您每次做的好，是您的操作比较仔细，而且严格按照说明书操作，所以不会有什么大问题的。不同的人做结果会有差距。“无他，唯手熟耳”

欢迎继续提出问题！

下面是我之前找的一些参考资料，比较零散，请楼主先看着哈！也不知道适不适合您的“胃口”

酶联免疫吸附实验 ELISA

一．实验目的
酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。


二．实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O•D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O•D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

基本方法二　用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

（二） 酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物

酶    底物    显色反应    测定波长
辣根过氧化物酶    邻苯二胺    橘红色    492*
    四甲替联苯胺    黄色    460**
    氨基水杨酸    棕色    449
    邻联苯甲胺    兰色    425
    2,2＇-连胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）铵盐    蓝绿色    642
碱性磷酸酯酶    4-硝基酚磷酸盐（PNP）    黄色    400
    萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐    红色    500
葡萄糖氧化酶    ABTS+HRP+葡萄糖    黄色    405,420
    葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰    深蓝色   
β-Ｄ－半乳糖苷酶    甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG）    荧光    360,450
    硝基酚半乳糖苷（ONPG）    黄色    420


* 终止剂为2mol/L H2SO4
** 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。
可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体； A—— 为有色产物。

（三） ELISA常用的四种方法

1．直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面；
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
加底物。底物的降解量＝抗原量。

2．间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面；
加抗体, 形成抗原-抗体复合物；
加酶标抗体；
加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。

3．双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;
加底物。底物的降解量＝抗原量。

4. 竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
（1） 加入酶标抗原；
（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；
加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

三．仪器和材料

1. 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 40, 96孔）。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液：同稀释液
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制 0.1M 柠檬酸（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O　（7.163g/100ml）　6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液：2mol/LH2SO4。

四. 操作步骤
1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

有配好的标准溶液那是最好了

这个也有，但价格会高