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高效液相色谱仪（HPLC）校正方法

yifan1117

2012/03/20

0.1 输液系统：

0.1.1 梯度误差G_C不超过±3%

0.1.2 泵流量设定值误差 S_s＜±2%

0.1.3 流量稳定性误差 S_R＜±2%

0.2 紫外检测器性能

0.2.1 基线噪声不超过5×10^-4AU，基线漂移不超过5×10^-3AU

0.2.2 定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5%

0.2.3 最小检测浓度不超过1×10^-7g/ml萘/甲醇溶液

0.2.4 可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成)

1 校正条件

1.1 环境温度10-30℃，相对湿度低于65%

1.2 校正设备

1.2.1 秒表分度值小于0.1 s

1.2.2 分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg

1.2.3 容量瓶

1.2.4 微量注射器

1.3 标准物质和试剂

1.3.1 HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮

1.3.2 1×10^-4g/ml，1×10^-7g/ml的萘甲醇溶液

1.3.3 紫外波长标准溶液

2 校正方法

2.1 梯度误差G_C的校正

2.1.1 进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%，20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100%

Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值

可接受标准： -3%≤Gci≤3%

2.2 泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S_R的校正

2.2.1 将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25分钟，称重，按下式计算流动相流量设定值误差Ss和流动相流量稳定性误差S_R。公式：Ss=（Fm-F_S）/Fs 100%

可接受标准：-2%≤Ss≤2%

S_R=（Fmax-Fmin）/F×100%

可接受标准：-2%≤S_R≤2%

Ss：流量设定值误差（%）； Fm=（W₂- W₁）/ρt.t：流量实测值（ml/min）

W₂：容量瓶+流动相的重量（g）； W₁：容量瓶的重量（g）； Fs：流量设定值（ml/min）；

ρt：实验室温度下流动相的密度（g/cm³）； t：收集流动相的时间（min）；

S_R ：流量稳定性误差（%）； Fmax 为同一组测量中流量最大值（ml/min）；

Fmin：同一组测量中流量最小值（ml/min）； F 为同一组测量值的算术平均值（ml/min）

表一：Ss和S_R的校正

流量设定值（ml/min）

1.0

1.5

测量次数

3

3

收集流动相时间（min）

15

10

允许误差

S_s

2％

2％

S_R

2％

2％

2.3 基线噪声和漂移

2.3.1 选用C18的色谱柱，以波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min，仪器稳定后记录基线30min，求基线噪声N_d。可接受标准：N_d≤5×10^-4AU

2.3.2 基线漂移用1h内基线偏离原点的值（AU/h）表示。可接受标准：D≤5×10^-3AU/h

2.4 最小检测浓度

2.4.1 以上述色谱条件下，进样20ul的1×10^-7g/ml的萘甲醇溶液，计算最小检测浓度C_L。公式：

C_L=

2 N_dC×20

HV

N_d：基线噪声，mm； C：标准溶液浓度，g/ml；

H：标准溶液色谱峰的峰高，mm； V——进样体积，ul。

2.4.2 可接受标准：C_L≤1×10^-7g/ml

2.5 定量测定重复性的校正

将仪器联接好，使之处于正常工作状态，波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min,用萘的甲醇溶液连续进样6次记录下峰面积，按下式计算相对标准偏差：

n

RSD = [∑（Xi- X ）²]/（n-1）×(1/ X )×100%

I=1

RSD：相对标准偏差（%）； n：测量次数； Xi：第I次测量的峰面积

X – n次进样的峰面积算术平均值

可接受标准：RSD≤1.5%

2.6 波长示值误差

2.6.1 用注射器将紫外波长标准溶液（标准波长为235nm，257nm，313nm和350nm）从检测器入口注入样品池冲洗，并将池充满，将波长调到低于标准波长5nm处，到标准波长+4nm处，测得的最大吸收值处对应的波长与标准波长之差为波长示值误差；目前仪器可以在1ml/min的流量下，直接用空管连接检测器，每隔2min改变1nm，连续进标准样10ul，同样可得波长示值误差。

2.6.2 可调波长紫外可见光检测器波长示值误差 (此项只适用于HP1100高效液相色谱仪且带有HP工作站)。

2.6.3 打开HP1100液相色谱仪和HP工作站，打开输液泵和检测器，用纯水冲洗系统直至稳定，进入 Diagnosis窗口，点击氘灯图标，进入 show module tests状态，点击VWD VL calibration test 点击start ，系统自动进入校正状态，待校正完毕，将校正结果打印归档。

2.6.4 可接受标准：λ≤2nm

3 性能确认

3.1 使用标准品或供试品，确认仪器性能符合使用要求；

3.2 先进行色谱柱的性能确认，内容包括：分离度，对称因子，理论塔板数和峰面积标准偏差。

3.3 液相色谱柱的确认

3.3.1 测试标准样配制：称量1000mg苯酚，100mg联苯加入到100ml容量瓶中，移入邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯各1ml，然后用甲醇定容到100ml，混匀，从中移取1ml该溶液，用乙腈：水=70：30定容至100ml。

3.3.2 方法：流动相为乙腈：水=70：30，流速为1.0ml/min,波长为254nm,温度为30℃，进样量为：10ul,运行10min。

3.3.3 色谱柱：Extend-C18 Analytical, 5um,4.6*250mm。

3.3.4 连续进行5次分析，分离度均R＞1.5；邻苯二甲酸二乙酯对称因子S在0.80～1.50范围内；邻苯二甲酸二乙酯柱效＞3000m^-1；邻苯二甲酸二乙酯峰面积的标准偏差应≤1.5%。

3.4 按照性能确认方法逐步进行，并记录谱图；根据性能测试的结果，评价仪器是否符合性能要求。

4 校正结果处理和校正周期

4.1 校正结果全部项目均符合技术要求者，判为合格，方可使用。若某些指标达不到要求，关于仪器情况，仪器负责人以维修报告的形式报于QC经理，由QC经理批准维修方案。

液相色谱仪的校正周期为一年。

分
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happy爱米粒

第1楼2012/03/29

几乎没有自己矫正过仪器呢，呵呵，都是专业的鉴定部门上门校正的

0

yu3226033

第2楼2012/03/29

正常使用多长时间校正一次?

0

dahua1981

第3楼2012/03/30

应助达人

我们是一年一次
都是外校

0

yifan1117

第4楼2012/03/30

正常是一年，其他的看自己要求!

0

天天想你

第5楼2012/03/30

一般都是仪器厂家工程师来弄的自己弄了几回效果不好

0

天天想你

第6楼2012/03/30

是的最好自己不要弄还是找仪器工程师
木有才(xgy2005) 发表:几乎没有自己矫正过仪器呢，呵呵，都是专业的鉴定部门上门校正的

0

dahua1981

第7楼2012/03/30

应助达人

不用仪器工程师
计量部门就行
天天想你(littlejie) 发表:是的最好自己不要弄还是找仪器工程师

0

天天想你

第8楼2012/03/30

哈哈我们这计量的来就是贴计量合格标签无实质性工作
dahua1981(dahua1981) 发表:不用仪器工程师
计量部门就行

0

yifan1117

第9楼2012/03/30

干嘛找仪器工程师呢？不是法定机构检测吗？

0

yu3226033

第10楼2012/03/30

一般维修时才校正.
天天想你(littlejie) 发表:是的最好自己不要弄还是找仪器工程师

0

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