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基因工程的操作步骤
省部重点实验室
2012/04/21
私聊
电泳仪
第一步:目的基因的制取:
用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切,产生一系列大小不等的DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因,是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段,能编码某一产物或某一性状。
目前获取目的基因的方法主要有三种:反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法.
第二步:基因载体的选取:
用人工方法,取得目的基因的适宜的载体,即质粒(一种环状双链DNA)或病毒。载体一般带有必要的标志基因,以便进行检测。
基因克隆载体必须具备三个条件:
a.具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。
b.能携带外源DNA进入受体细胞,或游离在细胞质中进行自我复制,或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。
c.必须具有选择标记,承载外源DNA的载体进入受体细胞后,以便筛选克隆子。
基因工程的基本过程(点击放大)
第三步:DNA的体外重组:
即用人工方法,让目的基因与运载体相结合,首先要用限制性内切酶和其他一些酶类,切割或修饰载体DNA和目的基因,然后用连接酶将两者连接起来,使目的基因插入载体内,形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行,所以基因工程操作又叫体外DNA重组。
第四步:DNA重组体导入受体细胞:
将外源DNA片段与载体DNA连接形成DNA重组体,即重组DNA。
这种重组体连接的方法主要有:
粘性末端连接法:应用同一种限制性内切酶切割载体和外源DNA分子,可产生相同的粘性末端(接口处的碱基互补),进一步用DNA连接酶将断口连好,即可获得重组DNA分子。
DNA重组体导入受体细胞
钝性末端连接法:用化学合成法或逆转录法得到的外源DNA片段,均为钝性末端,这种末端也可以用特殊的连接酶连接,但效率太低。通常需要用人工方法加上粘性末端,再进行连接。
第五步:受体细胞的繁殖扩增
:
含重组DNA的活受体细胞,再在适当的培养条件下,并进行繁殖和扩增,使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加。
第六步:克隆子的筛选和鉴定
:
受体细胞经转化(传染)或传导处理后,真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分,而绝大部分仍是原来的受体细胞,或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子,需要对克隆子进行筛选和鉴定。
第七步:目的基因的表达。
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