电泳图片光密度分析原理与方法

一、 暗箱
一个最简单的暗箱就是个不透光的箱子里面放了一个紫外灯箱，高级一点的暗箱则有好几组灯光照明。当然，在箱子上面会有一个安放相机的地方。
紫外灯箱是观察与拍摄凝胶的必需照明设备。它是用来观察EB染色的凝胶条带的。里面的紫外灯光能提供256nm,302nm及365nm的紫外光。在观察EB的红色荧光条带时，一般用302nm。
在观察与拍摄蛋白凝胶的时候，必须使用透射白光照明。有的暗箱里会有白板照明灯，平时向上掀起靠在后壁上，使用时拉下来。简单的暗箱则是用一块荧光板放在紫外灯箱上面，用紫外光照射荧光板，发出白色光。用白板的透射光照明来拍摄蛋白凝胶的道理有点像医院里用灯箱来观察X光片。只有在透射光下，才能正确地反映凝胶上条带的光密度分布。

暗箱上面也有白光照明与紫外光照明。这是用来拍摄普通样品的灯光。比如拍摄Western blot膜。
实际上一个照明配置完整的暗箱绝不仅仅是用来拍摄凝胶的。它可以拍摄多种小的实验样品，如组织与器官等。
图片：透射光下拍摄的蛋白凝胶图片条带层次很丰富的。普通照明下是没这个效果的。

二、 相机与镜头系统。
凝胶成象系统使用的是单色数码相机，这是分析凝胶光密度的要求。使用单色相机的优点在于其感光度高。这对于拍摄强度很弱的荧光凝胶或化学发光膜都是必需的。数码相机从普通到高级的都有。最基本的应该配置一台冷CCD数码相机。要拍摄化学发光膜的话，最好是配置致冷温度能达到低于环境20-30度的冷CCD相机。与使用胶片曝光相比，用冷CCD拍摄化学发光的WB膜不仅仅是方便，而且具有更好的图片效果。而且能准确地控制曝光。

左图是普通照明下的膜片，右图是化学发光图像。一般来说，图片能拍摄得比压片干净漂亮而且能控制曝光正确。注意到图片上有一个个细小的亮点吗？这叫热噪声点。CCD的致冷温度越低。这种热噪声点就越少。这张图片是低于环境温度10度的冷CCD相机拍摄的。如果是普通相机，画幅上的样品会被热噪声点给淹没的。拿自己的数码相机在黑暗处不用闪光灯照点啥就能体会到了。

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在拍摄弱光样品时，要使用相机拍摄12位灰度甚至16位灰度的单色图片。这样能使得照片上暗光部分有充足的细节表现。这样才不辜负价格昂贵的冷CCD相机。这种照片文件会很大，而且只在专业的图片软件上才能显示，在电脑的普通程序上需要经过转换才能显示。但它对于分析电泳条带是非常有利的。

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拍摄弱光样品时采用的是积分曝光方式，不停地拍摄，不停地显示，直到曝光满意为止。所以肯定能得到一张满意的照片。

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镜头系统也是凝胶成像系统的一个重要部分。它与普通的照相机变焦镜头功能相同，不过是对焦距，变焦放大缩小，还可以调整光圈。但不一样的是，它是一个近摄镜头，放大倍数在0.1倍到4倍之间。正好填补了显微镜与日常用数码相机的放大倍数之间的空缺。所以有时候制作的大体切片，在显微镜上不能完整拍摄的时候，也可以放到这里拍摄。
在拍摄荧光样品时，必须使用滤光片来过滤掉激发光。最常见的就是在拍摄EB染色的凝胶时必须使用红色滤光片。
左图：普通相机未加滤光片拍摄的凝胶照片。右图：用冷CCD拍摄的凝胶照片。

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关于CCD相机的另一些指标：
拍摄凝胶的专业CCD相机要用单色的。不能用彩色的。
CCD相机的象素基本上都在一百万多一点。拍摄的照片像素就是1000 X 1000多一点。
好的CCD相机能拍摄12位深度甚至16位深度的灰度图片。这是拍摄弱光样品所必需的。
冷CCD拍摄弱光样品时感光度更高。像化学发光膜这种弱光，最好用低于环境温度20度的冷CCD拍摄。
拍摄凝胶照片有什么技巧？有。
第一个注意事项是要把样品图片拍摄得尽可能大。让样品充满整个画面。样品拍得越大，测量就越准确。
第二个注意事项是要调整好曝光，不要让条带过亮或过暗。曝光过度的条带在光密度分析时肯定是错误的。
第三个刚才已经说了，要保存图片为TIFF格式。不能保存为jpeg格式。在拍摄弱光样品时，还必须保存为12位或者16位灰度的图片，这样的照片能保存肉眼不能分辨的弱光。在分析图片时，能从line profile上能够发现肉眼看不见的条带峰。

图片：当凝胶为竖长条的时候，可以把它横过来拍摄，能拍得大一点。

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三、 电脑上的控制与分析程序
到现在才讲到凝胶分析软件了。几乎所有的凝胶分析软件都集成相机控件，可以在程序上直接控制相机。如果是高级点的暗箱，它的照明控制也能集成到软件上。这样拍摄与分析就直接在凝胶分析软件上完成了。

凝胶分析软件最基本的分析功能就是分析电泳条带的位置（可以测量条带分子量）与条带的光密度（可以测量相对的条带质量），叫作“1D-gel分析”。各种不同的软件操作方法不同，但都是在以下面这个程序进行分析：
图片：分析软件上的ＣＣＤ相机控件与镜头控件。

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