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土壤农杆菌
省部重点实验室
2012/04/21
私聊
电泳仪
在自然界存在一种叫做土壤杆菌的细菌,它能感染植物的受伤组织,特别是根茎交接处的受伤组织,引起冠瘿瘤。冠瘿病损害为数众多的双子叶植物,特别是葡萄、核果类树木和观赏植物。冠瘿细胞是植物肿瘤细胞,在许多方面与动物肿瘤细胞类似。它们只有无限生长的能力,把一小块冠瘿组织放入不含植物激素的培养基中培养,能长成大的细胞团块(愈伤组织),而正常植物细胞在不加植物激素的培养基中则不能生长。冠瘤拥胞能制造一类叫做冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物(如章鱼碱和蓝曙红),供根癌土壤杆菌作为养料使用,在正常植物细胞中从未发现过这类物质。
根癌土壤杆菌能把植物细胞转化为肿瘤细胞,是由于它含有一种肿瘤诱导质粒,简称Ti质粒。当细菌感染植物时,Ti质粒中大约占这个质粒l/10的DNA片段(称为转移DNA或T—DNA)进入植物细胞,并整合到植物的染色体上,随染色体一起复制。随后T—DNA携带的细菌基因(致瘤基因和合成冠瘿碱的基因)使在植物细胞中表达,使植物细胞转化成肿瘤细胞,并合成冠瘿碱。由于根癌土壤杆菌能把细菌基因引入植物细胞,并在那里表达出蛋白质来,所以人们称它为天然的“遗传工程师”。这给人们以启示。能否用重组DNA技术把与高产、优质、抗病、抗旱和抗盐碱等优良件状有关的基因循人到T—DNA中,然后再通过根癌土壤杆菌的感染把这些基因引入植物细胞呢?最近几年的研究进展表明,这是完全可能的。
Ti
质粒是独立复制的环状DNA分子。由大约1.5—2xl0
5
碱基对组成,相当于细菌染色体的3—5%。它有两个主要类型:一类叫章鱼碱质粒,含有这种质粒的细菌能以章鱼碱为氮源和碳源生长;另一类叫蓝署红质粒,含有这种质粒的细菌能利用蓝曙红。每一种根癌土壤杆菌只含有一种Ti质粒,或者是章鱼碱质粒,或者是蓝曙红质粒。这两种质拉的DNA同源性很低,一般为12—16%,说明它们可能具有不同的进化史。
T
—DNA是Ti质粒中最重要的组成部分.它所携带的基因主要有两个功能:一是决定肿瘤的形成和肿瘤的形态;二是控制冠瘿碱的合成。如果T—DNA中的致瘤基因发生突变,可能出现三种表型:一是产生比正常肿瘤个大的肿瘤;二是使肿瘤长出许多根;三是使肿瘤长出许多芽。在T—DNA区域以外也有一些基因已被定位,其中毒性基因的功能是决定根癌土壤杆菌对植物的感染以及T—DNA的进入和整合;章鱼碱代谢基因和蓝曙红代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶;质粒转移基因控制细菌的接合作用;不相容性基因控制Ti质粒与其它质粒的不相容性。
Ti
质粒之所以能成为把外源基因引入植物的良好载体有两方面的原因。第一,携带质粒的根癌土壤杆菌的寄主范围很广,实际上它能转化所有的双子叶植物。第二,整合到植物染色休上的T—DNA能随种子遗传,而且T—DNA有自己的启动基因,可以启动与其连接的外源基因的转录。此外,也有人研究以植物病毒DNA为载体转移目的基因,或者直接把DNA注射到植物的花粉管和子房中。
Ti
质粒直接用作基因载体有两个困难:一是它的分子量太大,内切酶位点很多,不容易进行体外重组DNA操作;二是被T—DNA转化的植物细胞成为肿瘤细胞,不能再生成植株。克服第一个困难的办法是先把T—DNA克隆到大肠杆菌的小质粒上,把目的基因插入到小质粒的T—DNA中,然后再设法转移到天然的Ti质粒中。克服第二个困难的办法是在T—DNA的特殊位点中插入目的基因和供筛选用的抗药基因,一方面使致瘤基因发生插入突变,从而使转化细胞能再生成植株,另一方面使目的基因正好位于T—DNA的启动基因的下游,以便启动目的基因的转录。
有人经过研究发现了这样一种作用模型:大多数双子叶植物受伤后会产生一种叫丁香酮(acetosyringone)的物质,这时土壤农杆菌感染后,丁香酮在Ti质粒上Vir A的产物A的协同作用下促进了Vir G产物G的活化(即磷酸化),然后产物G相继激活Vir B、V ir c、Vir D、Vir E等操纵子,特别是Vir D和Vir E。前者产生两种蛋白,D1为缺刻酶(nickase),它能特异性地在T—DNA两端产生缺刻;D2则是一种蛋白复合物,它粘在已断开的T—DNA的两端,具“导航”的功能,有人认为它是Rec A,起重组的作用。后者产生单链结分蛋白(SSB),有保护缺刻产生后的T—DNA的功能。T—DNA在诸多蛋白的导航、保护下重组进核基因组。这种转比方法优点是方便,不需分离原生质,且插入的基因拷贝数目少,比较稳定。但它的缺点是土壤农杆菌主要只适于侵染双子叶植物,单子叶植物能被侵染的较少,这就在一定程度上影响了这种方法的推广。有人发现单子叶植物受伤后很少产生丁香酮,这是否是侵染的关键呢?目的许多实验室都在作这方面的探索,以期望能克服这种方法的局限性。
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