氨基酸分析技术的特点与内涵

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2012/05/03

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氨基酸分析技术的特点与内涵

文章来源：国家产品质量安全与法信息中心网添加时间：2009-7-19 3:13:19 点击：1510

摘要：在传统蛋白质分析技术基础上，结合现代分析仪器技术发展优势，针对氨基酸分析技术难点及存在问题，概括比较分析评价当前氨基酸分析技术特点。
关键词：蛋白质氨基酸分析技术研究进展
1 前言
迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。氨基酸主要有两种存在形式，一种是以游离态存在于生理体液(血浆、尿)、食品(酒、饮料)中；另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。
蛋白质在乳中含量为3.0%~3.5%，是乳的主要成分，对乳品的理化特性和营养价值有重要的影响。由于国标法对蛋白的检测是通过检测样品含氮量而得到的，实际上是将样品消化分解，经蒸馏碱吸收后，测定的挥发性“氨基氮”，因而部分不法商贩用添加外源动植物蛋白粉或脲等含氮化合物（虚“氮”）来增加原料乳的氮含量，钻传统检测方法表征“虚氮”的漏洞，以蒙混过关。这些掺入水解动物蛋白或者含氮化合物的乳粉因其氨基酸的组成不合理，根本不能代表动、植物蛋白，不易消化，所以营养价值低下，导致人体吸收利用率降低，严重地影响到婴幼儿的生长发育和智力水平。因此，对氨基酸分析方法的研究与改进逐渐得到各国家、全社会的高度重视。
在一般情况下，质量监督检验单位在市场上抽到产品进行检验所得的数据中，蛋白质含量实际上是用总氮含量表示的，所以在加工企业常规检验时、含氮化合物、水解动物蛋白等杂蛋白是测不出来的，因此需要建立快速分析、测定乳制品中蛋白质、氨基酸的检测方法，保障乳制品的质量与安全。[1],[2]
1958年，Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，人们不断地发展新的氨基酸分析方法，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、蛋白质芯片技术等相继应用于氨基酸分析。现已是多种氨基酸分析方法并存、互补。本文就目前应用于氨基酸分析的主要方法作一比较分析。[3],[4],[5]
2 氨基酸分析技术的光谱分析优势及特点
利用光谱探针方法定量分析蛋白质的研究在国际上十分活跃，其中，对有机染料(包括显色剂和荧光染料)结合分光光度法和金属离子-有机染料(包括显色剂和荧光染料)结合分光光度法的研究倍受重视。
2.1 有机染料结合分光光度技术
因为有机染料结合分光光度法测定蛋白质操作简便，比较灵敏，又不需特别的仪器，方法应用比较广泛。现在研究较多的可作为探针的染料分子中，大部分都含有带正电荷的亲水性基团如羟基、磺酸基、酚羟基及不带电荷的疏水性基团，如苯环。这类方法的基础是在溶液pH小于等电点时，蛋白质的肽键亚胺和N端氨基质子化成阳离子，若有阴离子染料存在时，由于电荷作用，蛋白质便与染料结合沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借染料颜色的减褪或变化的程度测定蛋白质的含量。已经应用的染料有酸性橙红、考马斯亮蓝G-250、溴甲酚绿、溴甲酚紫、埃铬青R和溴酚蓝。[3]
2.2金属离子-有机染料结合分光光度技术
近几年发展了利用金属离子和有机染料特别是荧光染料形成配合物体系结合光光度法来测定蛋白质含量。金属离子与含有-OH或C=O的有机染料相遇时，氧原子中的孤对电子可顺利进人杂化轨道，形成稳定的配合体系，在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质分子时，互相极化产生静电作用而结合成新的大分子团，改变了原体系的光谱性能，从而能定量测定蛋白质的含量。该方法具有灵敏度高、线性范围广、干扰离子少、操作简单、快速及适用于常规应用等特点。
2.3 荧光光度分析技术
荧光法是定量测定蛋白质的另一种常用方法通常比分光光度法更灵敏。常用的方法有内源荧光法、荧光探针法、荧光偏振、时间分辨荧光法及激光诱导时间分辨免疫分析法。
2.3.1 内源荧光分析技术
蛋白质中存在着Tyr、Trp、phe残基，能够吸收270~300 nm的紫外光而发出紫外荧光。当测定体系中加入小分子配体（SM）时，SM与蛋白质发生相互作用，会导致蛋白质荧光的猝灭，利用SM对蛋白质内源荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与SM的作用类型及其结合部位等。
2.3.2 外源荧光分析技术
对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要通过外源荧光性质的研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有着极其重要的意义，这已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中不可缺少的手段之一。在外源荧光法中，又可分为有机荧光探针法和稀土荧光探针法。作为一个好的荧光探针应满足以下条件：探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的结合，并且结合比较牢固；探针的荧光必须对环境条件敏感；蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定和与金属离子结合的计量化学等。
与光度法类似，蛋白质在和某些具有荧光特性的染料结合后，能引起荧光强度的变化，并且在一定浓度范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的测定。利用这些化合物在不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带的变化，就可探测蛋白质分子结合区的极性、疏水性的大小，从而推论构象的稳定情况及变化等。
2.3.3 荧光偏振分析技术
利用荧光体在转动扩散速度上的差异而导致偏振荧光的差别，建立了荧光偏振测定法。利用荧光偏振还可以研究：酶与荧光底物的结合程度；蛋白质聚合与解离；蛋白质从螺旋到无规卷曲的研究。[6],[7]
3 氨基酸分析技术的色谱分析优势及特点
3.1 柱后衍生高效阳离子交换色谱分析技术
高效阳离子交换色谱（HPCEC）-柱后茚三酮衍生光度检测分离测定氨基酸是一种经典的氨基酸分析方法。此方法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而在阳离子交换柱中分离，分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可见光检测器检测。
该方法以阳离子交换树脂为固定相、酸性缓冲液流动相，在柱后流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可见光吸收的衍生物进行检测，具有重现性好、仪器稳定、结果可靠、适合于大量常规样品分析等优点。另外，由于衍生化反应发生在氨基酸与其物质分离之后，因而避免了其他物质的干扰，适合复杂样品中氨基酸的分析。其缺点是仪器复杂、体积大、费用高。此外，由于脯氨酸的测定波长在440nm，而其他氨基酸的测定波长为570nm，因脯氨酸不能和其他氨基酸同时测定。
氨基酸分析自动仪就是基于阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生光度检测技术设计的。商品化的自动氨基酸分析仪是在20世纪60年代初问世，目前的自动氨基酸分析仪已实现了程控自动化和数据处理电脑化，分析时间已缩短至1 h以内。氨基酸自动分析仪实际上属专门用来分析氨基酸的高效液相色谱仪，其优点是高压、快速、灵敏，试剂和样品用量少、重现性好、分析结果稳定。广泛用于食品、医学、农业以及微生物等领域。[8]
3.2 柱前衍生反相高效液相色谱分析技术
近20年来，柱前衍生反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析氨基酸得到了迅速发展，逐渐取代柱后衍生高效阳离子交换色谱（HPCEC）在许多领域中的应用。RP-HPLC分析方法更加快速灵敏。与专业氨基酸分析的自动分析仪不同，HPLC仪适用性更广、更灵活。
RP-HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物，柱前衍生的关键在于衍生试剂的选择。选择衍生试剂的标准是能与各氨基酸定量反应，每种氨基酸只生成一种化合物且产物有一定的稳定性，不产生或易于排除干扰物，操作简单，色谱分离分辨率高、检测灵敏度高，分析时间短，便于实现自动化和使产物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定。目前比较常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）及丹酰氯（Dansyl-Cl）。
衍生后的氨基酸一般键合在C18柱上，利用液液分配原理进行分离。流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓冲液为主，以乙腈、甲醇或四氢氟喃为调节剂。由于氨基酸衍生物仍保留着两性化合物的特点，除改变调节剂之外，还可通过调节缓冲液pH值、离子强度、柱温等使之达到理想的分离。当然，不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同。柱前衍生反相高效液相色谱法可用于分析蛋白质水解液、生理体液和食品等样品中的氨基酸。
当与质谱技术结合时，采用电离喷雾质谱（ESI-MS）或电离喷雾串联质谱（ESI-MS/MS）联用技术方式，借助计算机的联机检索，可以实现高通量筛选和鉴定蛋白质混合体系。目前，，蛋白质组研究的高效液相色谱-质谱联用的方式有一维色谱-质谱联用技术、多维色谱-质谱联用技术以及亲和色谱-质谱联用技术等。一维色谱-质谱技术仅能分析一些不太复杂的蛋白质体系，而对复杂的多肽混合物常不能满足分离的要求。多维色谱分离的方法在某种程度上满足了对复杂蛋白质混合分离鉴定的要求。[9],[10],[11],[12]
3.3 两种氨基酸直接分析技术
大多数氨基酸不具备生色团，因此无法利用分光光度法直接检测，故需采用化学衍生技术，使之生成可在紫外或可见光区有吸收的化合物，或者采用荧光法检测。但对于分析工作者来讲，尤其是在新化合物研制的过程中，面对多种未知的降解物，如采用紫外检测器等，需事先用纯品定性，并求得各组分的响应因子后方能定量。这样，就产生两个问题，一是降解物纯品难以获得；二是无紫外生色团的物质需经化学反应产生生色团，就不可避免地出现反应产物的多样性。因此，经过衍生，再进行分析，很难判断降解物的来源，故非常需要不经衍生就能直接检测各组分的通用型检测器。
在氨基酸的分析中，如采用不经衍生就能直接检测的技术，可避免定量衍生中一级氨和二级氨衍生化产物不同，以及衍生化产物不稳定等带来的问题。
3.3.1高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测技术（HPAEC-IPAD）
HPAEC-IPAD是一种新的氨基酸分析方法。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位，可在贵金属（金、铂）电极表面发生氧化反应，从而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测。
此方法分析氨基酸不需要对氨基酸进行衍生化处理，可直接进行分离、检测，对氨基酸的检出限为pmol~fmol级。由于糖类化合物（含有多羟基）在强碱性介质中可以形成阴离子并可用脉冲安培法检测，因此，用HPAEC-IPAD亦可分析糖类化合物、氨基糖和糖酸等。
采用二模式积分脉冲安培检测法还可用于氨基酸和糖的鉴定。因为糖类化合物的检测电位比氨基酸的检测电位低，在较高的电位下，氨基酸和糖类化合物均被检测，而在较低的积分电位下只检测糖类化合物，氨基酸（羟基氨基酸除外）不被检测或检测信号很弱。这样，对氨基酸和糖类化合物的混合物可选择性地检测糖类化合物。
3.3.2蒸发光散射检测技术
蒸发光散射检测技术的工作原理是：经色谱柱分离的组分与洗脱液进入喷雾器，用空气或氮气流雾化，再流经可控温的蒸发器，使溶剂蒸发，而组分成为微小的颗粒，让它们高速通过蒸发柱及光源光路，在其穿过光路时导致光散射，散射光可用光电倍增管收集，从而得到样品信号。如果流动相恒定流速不变，散射光通量与流通池中组分的量成正比。因此，用光散射技术进行检测，样品无需具备紫外发色团和合适的折光率，并且对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感，是一种真正的通用型检测器。该检测器对被分析组分或杂质均有响应，且响应因子基本相同。
目前，这一检测技术已经在药物分析、生化物质测定、高分子分析、表面活性剂等方面得到广泛应用。
由此可看出，蒸发光散射检测技术与HPLC联用于测定氨基酸，具有明显优势：灵敏度高，可消除溶剂等的影响；对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱；可扩大液相色谱的应用范围，能消除杂质和流动相的紫外吸收干扰；无需测定校正因子就可进行定量分析；分析氨基酸无需柱前、柱后衍生，可一次进样进行测定。
这两种检测技术与HPLC结合用于氨基酸分析，不但促进了液相色谱法的发展，而且还为液相色谱法提供了更多功能，应用范围不断扩大，促进氨基酸分析技术的发展。[13],[14],[15]
4 氨基酸分析技术的衍生化毛细管电泳分析优势及特点
毛细管电泳（CE）具有微量、灵敏、柱效高的特点，适合于氨基酸手性分离和复杂样品中的氨基酸分析， CE是目前用于氨基酸手性分离报道较多的方法之一。方法所需样品量和溶剂消耗少、运行成本低、对环境污染小，在一台CE仪器上可兼容多种分离模式，因此适用范围广，广泛应用于生物、化学、医药、食品、环保等领域。
毛细管电泳分析氨基酸主要采用两种分离模式：毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。检测方式主要有紫外法和荧光法。由于检测池的体积小，光路短，紫外法的应用受到一定的限制。
衍生化毛细管电泳法除了可以进行柱前衍生化外，还可以进行柱内和柱后衍生化。柱内衍生化要求反应速度快，一般采用串联或“夹心饼”两种形式进行，具有试剂和样品用量少的优点。柱后衍生化可以避免柱前或柱内衍生化时其他化合物对衍生反应的干扰，缺点是柱后反应装置体积大，会引起色谱峰变宽而降低分离效果。用在衍生化高效液相色谱法中的多数衍生试剂也适用于衍生化毛细管电泳法。[16]
5 蛋白质芯片技术的优势及特点
蛋白质芯片技术是近年来建立的一种蛋白质分离技术，它是利用化学或生物学的方法在硅、云母、各种膜片等载体表面制作成点状芯池，每个芯池用探针修饰。这种探针包括结合蛋白质的抗体或受体、结合某些阳离子或阴离子的化学基团、吸水或疏水物质、酶、免疫复合物等。使用时，先将需要检测的样本按一定的程序做好前处理，然后在每个芯池内点入检测的样品，利用特定的探针和特定蛋白质结合的特性，将样品中的特定蛋白质分离出来，然后对芯片上的蛋白质直接进行质谱检测，从中得到样品中各种蛋白质的相对分子质量、含量、等电点、糖基化和磷酸化位点等信息。
用蛋白质微阵列分析样品时，对信噪比、分辨率、分析结果的重现性上具有较高的要求。目前，蛋白质芯片的检测方法主要可分为两大类：
（1）无标记检测方法。主要为各种仪器的检测，如质谱、表面等离子共振、电子显微镜等。其中被形象地称为具有飞行质谱技术的表面增强激光解吸离子化解决了样品在检测时需进行分离和纯化等繁琐前处理问题。此外，有人将具有电导能力的碳纳米线或纳米管应用于蛋白质芯片的信号传感系统，其检测限范围甚至达到飞摩尔级。
（2）标记检测方法。利用标记物所具有的荧光、化学发光等性质，再通过激光共聚焦扫描系统或电荷耦合照相系统对信号进行放大和分析。
由于蛋白质芯片技术具有快速、并行、自动化、高通量的特点，能够同时分析上千种蛋白质的变化情况，使得在全基因组水平研究蛋白质的功能成为可能。目前已经广泛应用于生物医学研究、蛋白质表达谱的分析、蛋白质功能及蛋白质与蛋白质间相互作用、新药的筛选和鉴定。
蛋白质芯片技术在食品中的应用将成为新的研究领域，但该技术本身还很不完善，随着科学研究的深入和科研工作者的不懈努力，其不足终会得到解决的。同时由于研究所需费用高，其产业化还需要时间和资金的投入，国家对高科技技术、新兴产业越来越重视，对芯片技术的投资正在加大，蛋白质芯片技术会更成熟，生产和应用的成本逐渐降低，在食品的生产、流通、检测等方面的应用会越来越普遍。[17],[18],[19],[20],[21]

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