省部重点实验室
第1楼2012/06/25
我们把标准曲线做好了,把曲线的方程式求出来,就可以得到一些统计的数据。这个时候 我们可以把每个浓度的峰面积带入方程式,求出浓度的实验值。这是实验值与原来配制的浓度比就是我们的回收率。这个回收率是根据标准曲线求出的。回收率当然是应该接近100%的。也就是我们的分析偏差接近於0。另外一方面,我们可以分别使用每一个对照品的浓度,求出该浓度的响应值(response factor),有了这个响应值,我们可以根据其他浓度的峰面积,求出每个浓度的实验值。有了这个实验值,我们可以与原来的配制浓度求出回收率。您就会发现,以高浓度为对照品来定量低的浓度回收率越小。反之亦然。如果以一个浓度来定量同样浓度,分析的偏差就不存在了。这也就是我们可以选择单一靶点浓度来定量的根据。但是要记住的就是样品的浓度一定要配制到对照品单一靶点的浓度。否则,偏差自然就大了。一般我们做色谱,除了杂质或相关物质。为了能够检测到0.1%的含量,我们通常是需要注射大量的样品。注入大量的样品,自然有许多问题。尤其在定量主成份上。所以,我是主张用两个单独的方法。一个是用来定量主成份,进样量小,时间短的等度色谱法。另外一个就是梯度,长时间,进样量大的方法来定杂质及有关物质。有问题,我一定尽量回答。同时也由衷知道您的想法。
省部重点实验室
第2楼2012/06/25
yuanhejun wrote:
1.标准曲线理论上是过原点,但是实际实验中,操作误差,称量误差,仪器噪音,等等因素可能造成曲线不过原点。y=A*x + B, 当B/A小于20%时候,在统计学上,无显著偏差。当线性下限很低时,可以设定为不大于10%。当这个数值过大时,需要特别注意,搞清楚为什么没过原点,需要给出科学的证明。不能简单的说就是不过原点。良好的线性,专属性和精密度,可以反映出良好的准确性。
2.另外,曲线具有一个范围,但是样品测试还有一个范围,后一个范围必须设在曲线范围之内。这就是我们在平时的测试中,样品浓度的配置范围。两次取样浓度没有必要越近越好,从统计学上来说,方法本身的误差,实验的误差,仪器的误差归结到一起,两次浓度的差异大小并没有对结果的判断产生影响。
3. 当方法的曲线是区间的,就是指不过原点。需要每次测试进行标准曲线的制定。如果说在此区间内,方法线性很好,两点校正是可以接受的。当然,点越多越能反映出该曲线的趋势。只是方法繁琐。反正分析员不值几个钱,不考虑也行。
基本上我是同意先生所言。有一点我要强调的就是统计学在分析化学上的应用。在1978年,我工作的公司还有其他美国其他12个化学公司受美国化学学会分析组及美国环保署的委托,试图订立分析化学方法认证的程序。后来这个变成了分析认证方法的指导原则,美国FDA到了1987年正式采用这个规则。以后有时间我会慢慢写出来。有一点我要强调的就是关于统计学的应用。我们知道一个分析方法的认证,实在无法在一定时间内取得理想的数据的数量(reasonable number of data points)。当然分析时间短的,可以多取得一些数据,分析时间如果超过一个小时一个样品,那24小时基本上就是只有24个点。因此,在我们做统计学的分析到底有多大的意义。当时电脑没有那么发达,所以我们自己设计统计的程序,不过大家就是心里有底,总要有个标准,就这样一直延续下来。譬如我们做线性分析,那个0.9999 跟0.99999,对于24个数据点的意义到底有对大。这都是我们避免去回答的问题。
对于我提到在使用单一靶点浓度对照品来定量样品时,在制备两个样品是的浓度最好接近对照品的浓度,也是当初我们的一个建议。这个建议完全是根据我在文中所提的分析偏差的分析。并没有统计学上的根据。我相信,如先生所言,就是以统计学的观点来演算,使用不同的样品浓度,结果可能也没有多大的区别。
至於分析员不值几个钱,这点可能是先生一时笔误。也许在国内是这种情形。一个分析员的价值在於对产品质量的控制。是不是值钱当然要看对产品的贡献如何。当年,我们一个价值10亿美元的产品,每年必须向美国环保署注册,就是分析方法的改进。过不了关,就是不准继续卖。在那种情况下,分析员值几个钱的说法就不存在了。我自己在分析领域干了32个年头。是不是值钱,我自己心里有数的。目前美国药业的发展,每一个环节,看看如果没有分析人员的后援,又是如何的结果。
省部重点实验室
第3楼2012/06/25
1标准曲线的下限。
1.1微量分析 现在仪器及技术的不断发展,基本上QL都在ng级了,QL在生物等效性,药动学研究等未知含量分析中对标准曲线的建立帮助很大。但为什么标准曲线的下限,大概设在高於2到3倍的QL。我认为标准曲线的下限应该是最低定量限这个点,这样才有分析意义。
基本上是已经到了pg了。不过我说的是药物的分析。您看做药动学的要求是在15%到20%的准确与精确度。但是我们做药剂含量的要求是1%到2%。如果把低限度往下推,就很难达到%RSD的要求。因为峰面积越小,峰面积的重复性就越难了。当然,做相关物质与杂质是另当别论。而%RSD的要求也比较宽。
1.2 制剂分析
美国FDA规定的标准曲线范围只是靶点浓度的上下限百分之五十。把制剂的含量,经过稀释后的浓度(1:100或1:1000) 定为我们的靶点浓度。我做标准曲线也是超过这个范围的。
有了标准曲线的范围,然后把样本拿来稀释,总是可以稀释到范围之内的。至于1:100 1:1000是举例子。当然要看您取样的多少而决定。
2标准曲线制作
六个浓度,每个六针。现在我使用的仪器是自动进样的,我多次试研证明自动进样的样品响应值的RSD均小于0.5%,标准曲线是否可以调整为六个浓度,每个一针?
六个浓度,每个六针,是在认证时候做的。以后就不必了。我觉得每次六个浓度,每次一针,由响应值来看也是可以的。不过有一点我要强调,我们做系统准确度的时候,不止是在开头做,其实整个进样过程都需要检查的。譬如我有30个样品,开始我做了系统检验,然后每隔5个样品进样,我还是要进样对照品的。所以我说配制两个对照品,然后第一个进样六针,第二个进样三针(两点决定一线。三点决定一个面,就比较有统计的意义了)。然后每个5个样品再进一针第一个对照品。一直到最后一针。这样从头到尾都有对照品的进样,才能说对整个系统有所掌握。
3样品分析
3.1 3个浓度,但是必须横跨下限,中限及上限。
3.2 一个浓度(靶点浓度)并选择高浓度的对照品(进样量少)。
3.3 样品的浓度一定要配制到对照品单一靶点的浓度(减小偏差)。
现在样品配置常采用两种方法:一是取药品最小包装量稀释到靶点浓度;二是取少量样品直接配置到靶点浓度。方法一准确度好,但试剂用量大,操作时间长;方法二简便,节能。先生认为我们应该选择哪一种方法?
如果能够一次配制到靶点浓度,就一次配完上样。手续多一步就增加一次误差。取量太小,就要注意样品的代表性。对液体而言不是问题,对固体制剂问题比较大。一般都是用整个片剂。在所分析的时候,考虑的是如何减少误差,对于节能,省药那都是其次的因素。
3.4 赞同:一个是用来定量主成份,进样量小,时间短的等度色谱法。另外一个就是梯度,长时间,进样量大的方法来定杂质及有关物质。