基于h-ER基因的水体类雌激素效应测定
前言：
写这篇文章源于当时看的一篇《体育学刊》的论文《奥运会我们拿什么招待客人?——环境激素(EDCs)对生物的影响》（http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-TYXK200708030.htm）。水和食物是奥运健儿每天都会接触到的。若水中的类雌激素效应较高，会对运动员内分泌系统造成影响，从而影响比赛成绩，严重者甚至产生长期健康风险（如生殖影响、致癌等）。
之前，环境激素类物质在奥运会水质检测中有涉及，但是仅以GC-MS定性定量，这样做可能会丢掉部分环境激素类物质，如某些重金属和某些大分子的环境激素效应物质。同时环境激素类物质非常之多，采用理化分析不足以将这些物质全覆盖。所以未来分析的导向一定是生物分析，以环境激素效应代替单个的环境激素物质理化测定。下面就为大家分享下我们最近做的一个基于h-ER基因的类雌激素效应测定。
摘要：目的：对水样中的环境激素含量进行定量测定。方法：重组h-ER基因酵母特异性地结合水中类雌激素化合物，产生具有生物学活性的酶，通过定量检测酶活，间接测定环境激素含量。结果：10-11~10-9mol/L的17β-雌二醇暴露下，标准浓度与β-半乳糖苷酶活呈S型曲线，相关系数0.984；该方法最佳检测范围为5.88×10-11mol/L~1.44×10-10mol/L；加标回收率在74%~108%之间。结论：该方法灵敏度高，在最佳检测范围内重复性好，能适用于地表水和污水厂进出水等水样的测定。
关键词：环境激素 h-ER基因 酵母
环境激素是指能通过干扰内分泌功能，引起个体、后代或人群可逆性或不可逆性生物学效应的化合物，又称内分泌干扰物[1]。随着工业化的进展和环境污染的加剧，环境激素在环境中的存在日益增多[2]。生活中大量使用的化肥、农药、防腐剂、添加剂、洗涤剂、激素类药物等，很多属于内分泌干扰物[3]。环境激素可以模拟或干扰正常激素内分泌调节功能，从而对动物及人类的发育、生殖功能产生不良影响[4]， 甚至与人类某些肿瘤( 如乳腺癌、 卵巢癌等) 的发生有关[5]。目前环境激素的检测方法有基于仪器分析的气质联用法，HPLC法、ICP-MS法等[6]和基于生物检测手段的酶联免疫测定法[7]、个体形态学检测法[8]、实时定量PCR法[9]、重组基因酵母法等[10]等。其中重组基因酵母法具有高反应性和低背景，其检测阈值较低等的优点[11]。
1.实验材料和仪器
分光光度计（cary50,瓦里安）；
全温振荡培养箱（SHZ-22，常州若基）；
恒温平板摇床（Titramax 1000，Heidolph，Germany）；
百级超净工作台（DL - CJ -1F，哈东联）；
涡旋仪（TM-1F，wiggens）；
冷冻离心机（TGL-16LG，XK）；
重组基因酵母干粉（购自无锡中科）
2.实验方法：
2.1 重组基因酵母的复苏与增殖
将酵母干粉倒入SC培养基中，200r/min，30℃培养48~72h，使1/10菌液600nm处光密度达到0.7~0.9。
2.2 环境类雌激素化合物的暴露和显色
将1ml酵母菌液加入8ml样品中，混入1ml浓缩培养基后，200r/min，30℃暴露培养3~4h，测定600nm处光密度。
离心后加入2.4mlZ-缓冲液,混匀后加入0.8mL氯仿。用涡旋仪2500rpm破碎细胞。加入0.8mlο-NPG（溶于Z-缓冲液），37℃，200rpm培养60min。加入0.8mL溶液C2终止反应，出现明显的黄色，放置2h后，6000rpm离心2min，用分光光度计检测上层液体420nm的光密度值（以双蒸水为空白）。
2.3 半乳糖苷酶活性计算
用以下公式计算半乳糖苷酶活性U：
OD420为采用8mL双蒸水暴露测得的420nm光密度值
V为测试用的菌液体积：0.4mL
t为反应时间：60min
D为稀释因子：12
2.4 环境类雌激素-半乳糖苷酶曲线绘制
利用ORIGINE软件分析17β-雌二醇双蒸水溶液建立的浓度-酶活性关系，使用Doseresp曲线进行拟合。经适当稀释后，计算样品的17β-雌二醇当量浓度。
3.实验结果与讨论
3.1 酵母干粉复苏
培养48h，稀释10倍，酵母菌液的OD600值为0.481，低于0.5的实验要求；培养60h后，稀释10倍，酵母菌液OD600值为0.801。E2（17β-雌二醇）暴露实验于60h后进行。
3.2 E2校准曲线的测定
3.2.1 暴露后酵母菌液浓度
对E2暴露后酵母菌液浓度用分光光度计进行测定，以600nm处光密度(OD600)表示。测试结果
±0.006。相对偏差仅0.63%，说明实验过程中各暴露浓度的酵母菌菌液浓度较为一致。在设计浓度梯度内，E2未对酵母菌的生长繁殖产生明显抑制（高浓度暴露下菌液光密度与对照基本一致）。
3.2.2 环境激素效应曲线的测定
对已复苏的酵母菌用10-11~10-9mol/L的17β-雌二醇暴露4h。加入反应底物，测试暴露后各浓度梯度中半乳糖苷酶活性U。使用Doseresp曲线进行拟合，测试结果如图1所示。
图1 17β-雌二醇效应曲线
A1=-0.054，A2=0.939
lgx0=9.63×10-11，p=1.31×10-10
相关系数r=0.984
3.3 方法检出限的测定
实验对照采用双蒸水，与样品同时操作。2个实验空白测试结果均为0.0260。以分光光度法0.01吸光度差确定方法检出限。此时半乳糖苷酶活性为0.0524，代入17β-雌二醇效应曲线得到方法的检出限为2.62×10-11mol/L（即环境类雌激素效应含量超过2.62×10-11mol/L17β-雌二醇效应浓度，才可能被检出）。
3.4 方法检测范围的确定
由图1可知，当E2浓度大于2.5×10-10mol/L时，半乳糖苷酶活性基本保持不变，此浓度距离检出限浓度仅9.54倍。根据图1曲线，半乳糖苷酶活性最大值为0.938，以EC20和EC80确定方法检测范围，则方法最佳检测范围为5.88×10-11mol/L~1.44×10-10mol/L。当超出这个范围时，需要对样品进行稀释再行测定。
3.5 精密度检验
对使用10-11~10-9mol/L的17β-雌二醇暴露后的重组基因酵母菌的半乳糖苷酶活性的平行性进行分析，结果如表1所示。当E2浓度小于2.5×10-11mol/L，平行样偏差较大；而当E2浓度在5×10-11~10-9 mol/L时，平行样相对偏差较小，在0.8%~10.4%之间；当E2浓度达到2.5×10-9 mol/L时，相对偏差迅速升高，达到45.4%，这可能由于过高的E2浓度可能会对酵母菌的生长或半乳糖苷酶活性产生抑制，而这种抑制随个体差异有一定的不确定性。
表1 环境激素测试精密度分析
注：当半乳糖苷酶活性U小于0时，以0计。
3.6 方法准确度的确定
对污水处理厂进、出水、地表水进行加标回收分析。其中污水厂进水的回收率为加标后稀释分析。结果显示，方法的加标回收率在74%~108%之间。
表2 环境激素测试准确度分析
4 结论
重组基因酵母经类雌激素化合物暴露后，其半乳糖苷酶活性与类雌激素浓度符合Doseresp曲线。方法检测范围5.88×10-11mol/L~1.44×10-10mol/L（以17β-雌二醇计）。加标回收率在74%~108%之间。能适用于地表水和污水厂进出水等水样的测定。
参考文献
[1] 赵海涛,张天宝.内分泌干扰物筛检方法研究进展[J].毒理学杂志.2005,19(2):152-155
[2] 王玲,邹锟,刘衡川等.环境雌激素测评方法进展[J]. 现代预防医学.2005,32(12):1655-1657
[3] 吴二社,张松林,刘焕萍等. 农村环境中内分泌干扰物的现状、危害及处理[J]. 中国农学通报. 2011,27(14):282-285
[4]US EPA.Endocrine disrupter screening and testing adviort committee (EDSTAC) final report[R].Washington DC. U.S. EPA,1998
[5]Fox，GA1 Effects of endocrine disruption chemicals on wildlife in Canada：past、present and future[J]．Water quality research of Canada.2001,361
[6] 杜会芳,闫慧,芳审校.环境内分泌干扰物检测与分析方法研究进展[J].2005,34(4):493-496
[7]Zhao MP，Li ZY，Guo ZQ，et al.A new competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of estrogenic bisphenols[J].Talanta.2002,57:l205-l210
[8]Legler J，van den Brink CE，Brouwer A，et a1．Development of a stably transfected estrogen receptor-mediated luciferase reporter gene assay in the human T47D breast cancer cell line[J]．Toxicol Sci，1999，48：55-66．
[9]赛林霖,张照斌,胡建英等.实时定量RT-PCR方法评价壬基酚的雌激素效应[J].环境科学,2006，27(9)：1825-1828
[10] Yoo EJ，Jang YK，Kimm HS，et a1．Development of a new xenoestrogen screening system using fission yeast Schizosaccharomyces po mbe[J]．Mol Cels,2002,13:148-153
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