鼠伤寒沙门氏菌法测定水体生物遗传毒性

水源守护者

2012/10/19
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鼠伤寒沙门氏菌法测定水体生物遗传毒性

前言

这是本人在单位即将开讲的一个项目。写成文字形式，和大家分享下吧。目前，生物监测在中国现行的环境监测体系中还属于比较薄弱的环节。但随着科学技术的发展和民众环保意识的觉醒，人们不再满足于少数几个环境理化污染指标（相对于广大的化学污染物家族来说，现行监测的指标只能说沧海一粟），而越来越倾向于环境毒性物质对人体毒性危害的探索。

一、生物遗传毒性概念

1. 什么是生物遗传毒性

遗传毒性是指环境中的理化因素作用于有机体，使其遗传物质在染色体水平、分子水平和碱基水平上受到各种损伤，从而造成的毒性作用。遗传毒物引起生物细胞基因组分子结构特异改变的有害效应称为遗传毒性，也称为基因毒性。

这里注意一点，很多人会认为遗传毒性就是对下一代的影响（我们领导也这么想过），其实这是个误区。此“遗传”为细胞、分子水平、非生殖遗传！！

2. 生物遗传毒性来源

生物遗传毒性又称为基因毒性（其实不完全，但是99%是这种情况，具体下面会讲到），所以从另一个角度讲，其结果就是我们常说的基因突变。我们都知道基因突变有自发突变和诱发突变两大类。所以其来源也分为自发和诱变两大类。

自发突变：特点是发生过程长，频率低，与物种进化有关。

诱发突变：发生过程短，频率高，对人类造成不可逆的危害。

这里，我们主要研究化学物质引起的诱发突变。（其实诱变因素还有很多，比如紫外诱变、放射线诱变等等）

二、遗传毒性危害

1. 遗传毒物作用机制

作用机制有两种：DNA为靶的损伤（基因突变和染色体结构畸变）和非DNA为靶的损伤（染色体数目畸变，包括整倍体和非整倍体改变）。一般来说，低浓度遗传毒物以基因突变为主。这也就是为什么前面说只是99%，严格说不是完全的基因突变了。

☆这是遗传毒物作用机制的简图，虽然从图中看基因突变只是遗传毒性的一个分支，但据报道，这个绝大多数的DNA错误都发生在这里。（这个图只是为了让大家更直观地了解这个作用的过程）

2. 遗传毒物的危害

由作用机制的图中我们可以看到，遗传毒性主要表现在遗传毒物对于DNA的损伤以及DNA在修复过程中的错误所导致。当外界毒物超过DNA修复效率的“阈值”时，其危害作用就显现出来了。其危害主要体现在体细胞突变造成的致癌、致畸、老化、功能缺陷；以及生殖细胞突变造成的流产、死产、先天疾病等。

☆这是遗传毒物作用下DNA损伤带来的危害简图

3. 遗传毒物的危害途径

☆这个图是遗传毒物经过不同途径危害人体的一个流程图。

我们知道多数遗传毒物在低浓度下危害较小或者不显示出显著危害作用的，但这并不表示其没有毒性。当它们经食物链浓缩后可能大大高于毒性阈值而引发遗传毒性毒性效应。同时，如二噁英、苯并芘等被证实的高遗传毒性物质在低浓度下就会对人体产生较大危害。

三、遗传毒性的测定

鉴于遗传毒性的那么多危害，建立遗传毒性分析方法就变得非常必要了。

1. 遗传毒性测试方法概述

目前在各高校和研究机构的努力下，遗传毒性的分析方法得到了很大的发展。总体上说，根据检测的目标物不同，可以分为检测染色体畸变的方法、检测DNA损伤标志方法、检测基因突变的方法，此外还有基于现代分子生物学技术的方法等。

由于基因突变是遗传毒性危害的最主要表现形式，所以通过检测基因突变来反应污染物遗传毒性的研究相对较多。目前主流的检测基因突变的方法有哺乳动物细胞突变分析、微生物回复突变分析、昆虫突变分析等。其中哺乳动物细胞突变分析的结果更为接近人体，但是该技术发展时间不长，方法成熟度不高，导致结果的偏差较大，可重复性低。昆虫突变分析使用黑色果蝇的性连锁隐性致死（SLRL）测试，这个方法基于昆虫的下一代分析，耗时较长。微生物回复突变分析遗传毒性如AMES试验，是目前最快速的遗传毒性分析方法，所以为更快地确定污染水体的遗传毒性，我们环境监测优先考虑使用微生物回复突变试验作为衡量遗传毒性的定量方法。

☆基于生物的遗传毒性检测方法

2. 基于鼠伤寒沙门氏菌的遗传毒性测试方法

这方法是我最近引入开发的新方法，其原理与传统的AMES方法类似，只是把计数方法由平板培养变成了96孔板计数。

2.1 试验原理

根据营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌菌株与受试样品中污染物温育后在缺乏相应营养物的培养液中的生长情况判断受试样品的诱变活性。

我们的试验使用TA102突变菌株，该菌株测试的是移码突变和碱基置换突变。这两种是最常见、频率最高的突变类型。当然也可以用其他的突变菌株，其结果可能有较大差异，所以在分析结果时必须注明使用的是什么菌株。最好是多菌株联用，但是费用较高。

☆这个是移码突变

☆这个是碱基置换突变

2.2 试验步骤

明白了原理，分析就变得比较方便了。简单地说，该试验分为细胞培养、样品预处理、样品暴露、结果分析四个步骤。

2.2.1 鼠伤寒沙门氏菌的复苏与培养

☆无菌条件下打开培养基和菌干粉

☆充分混匀

☆37℃，200rpm震荡16-18h

2.2.2 样品预处理

☆0.2μm抽滤。这样做主要不是去除浊度，而是去除水中杂菌干扰

2.2.3 样品暴露

☆加入一定量样品

☆加入鼠伤寒沙门氏突变菌株

☆用漩涡混匀仪混匀。这里漩涡混匀仪功率不要太大，否则容易破碎细胞。

☆96孔板分装。先把试管中的混匀液倒入排槽中，再用排枪移至96孔板中，之后37℃培养5天。建议买12道的，这样一个板可以少移4次。这点对于批量的样品来说差距太大了

2.2.4 结果分析

☆5天后看结果，先来看下结果怎么看。黄色为阳性孔，紫色为阴性孔。

☆这个表不是我做的，是前人用大量数据统计得到的。做法类似于粪大肠菌群的MPN表。工作量非常大。怎么看这个表呢？第一列为空白对照中阳性孔数量，有时候用到其他溶剂，所以背景对照可能不全阴性。红色的0.05,0.01,0.001为α，也就是（1-置信度）。若背景对照的阳性孔数为10，那么在95%置信度下，大于19个阳性孔的样品为阳性结果；在99%置信度下，大于23个阳性孔的样品为阳性结果；在99.9%置信度下，大于27个阳性孔的为阳性结果。

☆左图为阴性对照，右图为强阳性对照。这种质控一般在每批样品中都必须执行。生物试验如果没质控，数据出现偏差概率还挺大。

2.3 方法的准确度分析

我们采用蒸馏水为背景空白。空白阴性对照组实验结果为0个阳性孔（96孔均为阴性）

丝裂霉素C（MMC）阳性对照实验结果为42个阳性孔（54个阴性孔）

取95%置信区间，≥3阳性孔即为阳性结果；所以MMC阳性对照结果为强阳性，符合试验要求。

2.4 精密度与实际样品分析

由上表可知，该方法的平行双样分析结果较为接近，且结果判断均一致，方法还是有较高的精密度。

2.5 分析结论

分析的某化工厂与某河流受污染，有较高的遗传毒性（p<0.05，移码型或碱基置换型）。

分析的电镀厂水样的遗传毒性较小，未见鼠伤寒沙门氏菌（TA102菌株）诱变活性。

四、展望

以前我们也做生物毒性，但做的多数是急性毒性，即使亚急性或慢性毒性，也只是对于受试生物死亡率的判断。未死亡的或死亡数量非常少的，一般就认为没毒性的。深入了解遗传毒性后，仔细品味，我们就会发现这个观点是多么的愚昧。某些遗传毒性物质在低浓度下虽然不会致死，但可能在某些层面上表现出疾病（如癌症、不孕不育症等）。多么可怕的事实啊。所以我相信在不久的将来，遗传毒性测试方法一定会普及，水质遗传毒性测试指标一定会被列入到环境监测或污染源监测的常规监测项目中。

当然遗传毒性的测试方法也不可能一成不变的，它一定会向着更低的假阴性、假阳性方向发展，且分析时间可能进一步缩短。