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毛细管区带电泳无峰???如何解决?---找到原因!

  • threetigers107
    2012/12/25
  • 私聊

毛细管电泳(CE)

  • 各路大侠帮忙看看,

    以不同的buffer(磷酸盐缓冲液pH2.5, pH 6.0,硼酸盐缓冲液pH 8.0, 9.0, 10.0,都是20mM, 15KV, 0.5 PSI,10S进样,分离时间30分钟)运行样品 (两个样品pI 6.0 ,另外一个是pI 7.5),进样之后就一直是一条平平的基线。磷酸盐的电流时12.5uA, 硼酸盐的电流时2.5uA。

    不知道是什么原因??该怎么解决呢?是样品吸附了么?项目很急啊,麻烦各位出谋划策啊,谢谢!

    另外,用做CE-SDS的SDSbuffer 走了下,如图(咕~~(╯﹏╰)b图在WORD文档里。。。)
    进样量是1mg/mL, 0.5psi*10s,这样的量应该够了吧?

    受某个帖子的回复启发,找到原因了。因为对一个方法参数没理解透,设置错误。就是polarity,有Normal和reverse之分。原来只以为它是管进样方向的,原来和分析模式有很大关系。因为之前做CE-SDS,用的是REVERSE,在做CZE的时候就没改这个参数,所以连测试样品都不出峰。不过我还没有搞清楚分析模式-样品-ploarity之间的关系。哪位帮忙扫盲下。谢谢~

    如果考虑用动态涂层或者直接买涂层的柱子,不知道各位有没有推荐的。感激不尽!!!

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  • nini2006

    第1楼2012/12/26

    直接帮你把图贴上来,方便大家看。

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  • nini2006

    第2楼2012/12/26

    电流太小了,特别是硼酸的,提高浓度试试。可以参考下文献,看人家用的什么内径的管子还有用多大的浓度。
    另外,当buffer的pH=pI的时候,蛋白质是不带电的,这样的话即使出峰也有可能跟其他中性物质混在一起分不开。

    个人很不喜欢SDS,这个东西会把迁移时间拖长峰变宽,而且不容易控制重现性。当然,你既然用了,条件就要摸索才行。有时候只是因为你跑的时间不够,峰还没出来就被你停掉了。

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  • threetigers107

    第3楼2012/12/26

    谢谢一楼帮我贴图。昨天搞了老半天不知道怎么弄上去,主要是电脑太慢了。。。
    看了一些文献,一般buffer用的浓度也不是太高,20,50,100mM不等;毛细管主要有50和75两种粒径的,长度40,50cm不等;分离时间的话就不太清楚了。不知道各位一般是多长时间的。我做的是一个多聚体的酶和一个peg化的样品

    nini2006(nini2006) 发表:电流太小了,特别是硼酸的,提高浓度试试。可以参考下文献,看人家用的什么内径的管子还有用多大的浓度。
    另外,当buffer的pH=pI的时候,蛋白质是不带电的,这样的话即使出峰也有可能跟其他中性物质混在一起分不开。

    个人很不喜欢SDS,这个东西会把迁移时间拖长峰变宽,而且不容易控制重现性。当然,你既然用了,条件就要摸索才行。有时候只是因为你跑的时间不够,峰还没出来就被你停掉了。

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  • nini2006

    第4楼2012/12/26

    既然有文献怎么会不知道时间?难道文献里居然一个图都没有?不同内径的管子对应不同的浓度,实在不行自己摸索。酶就是蛋白质的一种,可以借鉴蛋白质的分离模式。蛋白质的分离用等电聚焦电泳的比较多,当然也有用SDS的胶束电动色谱,但是如果用的silica-fused capillary吸附比较厉害,可以考虑用其他无胶筛分模式和动态涂敷的方式。

    threetigers107(threetigers107) 发表:谢谢一楼帮我贴图。昨天搞了老半天不知道怎么弄上去,主要是电脑太慢了。。。
    看了一些文献,一般buffer用的浓度也不是太高,20,50,100mM不等;毛细管主要有50和75两种粒径的,长度40,50cm不等;分离时间的话就不太清楚了。不知道各位一般是多长时间的。我做的是一个多聚体的酶和一个peg化的样品

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  • sunpengwjh

    第5楼2012/12/26

    CE-SDS楼主是选的胶束电动色谱么?如果是这样建议减少SDS的量,变成添加有机试剂的形势,这样试试看

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  • threetigers107

    第6楼2012/12/28

    我用Test A测试Test B,也是什么峰也没有。工程师说可能是柱子处理的问题。我是按照论坛里一个帖子上说的,用1 N NaoH/30min+1N Hcl/30min+0.1N NaoH 30min+水+buffer,处理的。不知道这样有什么不对

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  • nini2006

    第7楼2012/12/29

    柱子的前处理影响没那么大的。

    threetigers107(threetigers107) 发表:我用Test A测试Test B,也是什么峰也没有。工程师说可能是柱子处理的问题。我是按照论坛里一个帖子上说的,用1 N NaoH/30min+1N Hcl/30min+0.1N NaoH 30min+水+buffer,处理的。不知道这样有什么不对

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  • threetigers107

    第8楼2013/01/04

    这个我就是在很不理解了,为什么连test试剂的峰都不出,实在想不出原因。今天打算用BECKMAN的柱子试试

    nini2006(nini2006) 发表:柱子的前处理影响没那么大的。

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  • nini2006

    第9楼2013/01/15

    问题解决了就好。非常感谢你回来反馈和跟进,相信不少网友也能从中受益。

    受某个帖子的回复启发,找到原因了。因为对一个方法参数没理解透,设置错误。就是polarity,有Normal和reverse之分。原来只以为它是管进样方向的,原来和分析模式有很大关系。因为之前做CE-SDS,用的是REVERSE,在做CZE的时候就没改这个参数,所以连测试样品都不出峰。不过我还没有搞清楚分析模式-样品-ploarity之间的关系。哪位帮忙扫盲下。谢谢~

    如果考虑用动态涂层或者直接买涂层的柱子,不知道各位有没有推荐的。感激不尽!!!

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  • nini2006

    第10楼2013/01/15

    动态涂层的话,材料很多,可以结合自己的实际情况选择。不过我最近看用聚环乙烯(PEO)蛮多的,似乎满好用的样子。但我自己没做过,不敢乱说。呵呵

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