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一、实验原理
样品经水浸泡并混匀，加入乙腈沉淀蛋白，通过冷冻离心去除脂肪，取清液经过固相萃取SPE小柱净化，氮气浓缩至干，后用1.00mL 50%乙腈水溶液复溶，过滤膜上UPLC-MS/MS测定。采用电喷雾正离子电离(ESI+ )模式和多反应监控(MRM)扫描模式，外标法定量。该方法在5ng/ml～500ng /ml范围内线性关系良好，相关系数(r2)大于0.999。
二、仪器和试剂
超高效液相色谱串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。双氰胺标准品，固相萃取SPE小柱，VenusilHILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、甲酸、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。
三、实验方法
1.提取、净化称取2.5g试样于50ml具塞离心管中，准确加入5ml水浸泡溶解后，准确加入乙腈20ml，振荡混匀，超声10min，5500r/min冷冻离心5min，取5ml上清液过固相萃取SPE小柱净化，氮气浓缩至干，后用1.00mL 50%乙腈水溶液复溶，过0.22um滤膜上UPLC-MS/MS测定。
2.图文详解
①称取奶粉样品1.00g于50mL具塞离心管中，涡旋振荡混匀
②目标物提取和离心
③固相萃取净化
④氮吹浓缩
⑤溶解定容
⑥上机测定
3.仪器参数
3.1色谱条件：色谱柱：Agilent HILIC puls 3.5μm 2.1*100mm；流动相：A：2mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
B：乙腈
A：B=10:90
进样量：2ul；柱温：30℃；流速：0.3 ml/min。
3.2质谱条件液相色谱串联质谱联用仪：Agilent UPLC 1290& QQQ 6460；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测MRM；干燥气温度（GasTemp）325℃;干燥气流量（GasFlow）5mL/min，雾化器压力（Nebulizer）50psi，鞘流气温度（SheathGas Temp）400℃，鞘流气流量（Sheath Gas Flow）12mL/min，毛细管电压（Capillary）3500（+）V，MRM条件：双氰胺85.2>68.1（CE=19eV），85.2>43.0（CE=21eV）；4.实验结果
4.1线性关系和检出限准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng/ml的标准溶液，按照上述液质方法，结果见下表1：
表1双氰胺线性方程和定量限（UPLC-MS/MS法）
4.2检测方法稳定性考察选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表2：
表2检测方法定性和定量稳定性考察考察（UPLC-MS/MS法）
4.3.准确度和精密度选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表3。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表3 0.10mg/Kg添加回收实验结果
5 检出限
本方法仪器最低检测浓度5ng/mL，按照上述样品前处理计算，本方法检出限0.01mg/kg。未检出样品以＜0.01mg/kg报值。
“百家检坛”之乳品中双氰胺的检测：
http://www.woyaoce.cn/news/newsdetails.aspx?id=91350
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