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一、实验原理
样品经水浸泡并混匀,加入乙腈沉淀蛋白,通过冷冻离心去除脂肪,取清液经过固相萃取SPE小柱净化,氮气浓缩至干,后用1.00mL 50%乙腈水溶液复溶,过滤膜上UPLC-MS/MS测定。采用电喷雾正离子电离(ESI+ )模式和多反应监控(MRM)扫描模式,外标法定量。该方法在5ng/ml~500ng /ml范围内线性关系良好,相关系数(r2)大于0.999。
二、仪器和试剂
超高效液相色谱串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS),涡旋振荡器,超声波清洗机,氮吹仪。双氰胺标准品,固相萃取SPE小柱,VenusilHILIC液相色谱柱,微孔滤膜,乙酸铵、甲酸、乙酸、乙腈为色谱纯,实验用水为超纯水。
三、实验方法
1.提取、净化称取2.5g试样于50ml具塞离心管中,准确加入5ml水浸泡溶解后,准确加入乙腈20ml,振荡混匀,超声10min,5500r/min冷冻离心5min,取5ml上清液过固相萃取SPE小柱净化,氮气浓缩至干,后用1.00mL 50%乙腈水溶液复溶,过0.22um滤膜上UPLC-MS/MS测定。
2.图文详解
①称取奶粉样品1.00g于50mL具塞离心管中,涡旋振荡混匀
②目标物提取和离心
③固相萃取净化
④氮吹浓缩
⑤溶解定容
⑥上机测定
3.仪器参数
3.1色谱条件:色谱柱:Agilent HILIC puls 3.5μm 2.1*100mm;流动相:A:2mmol/L乙酸铵(pH=4.0)
B:乙腈
A:B=10:90
进样量:2ul;柱温:30℃;流速:0.3 ml/min。
3.2质谱条件液相色谱串联质谱联用仪:Agilent UPLC 1290& QQQ 6460;离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;
检测方式:多反应监测MRM;干燥气温度(GasTemp)325℃;干燥气流量(GasFlow)5mL/min,雾化器压力(Nebulizer)50psi,鞘流气温度(SheathGas Temp)400℃,鞘流气流量(Sheath Gas Flow)12mL/min,毛细管电压(Capillary)3500(+)V,MRM条件:双氰胺85.2>68.1(CE=19eV),85.2>43.0(CE=21eV);4.实验结果
4.1线性关系和检出限准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中,加水溶液并稀释至刻度,作为标准贮备液;分别量取一定量的标准贮备液,用乙腈稀释,配置成浓度为5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml和500ng/ml的标准溶液,按照上述液质方法,结果见下表1:
表1双氰胺线性方程和定量限(UPLC-MS/MS法)
4.2检测方法稳定性考察选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针,计算其保留时间和峰面积的RSD值,结果见表2:
表2检测方法定性和定量稳定性考察考察(UPLC-MS/MS法)
4.3.准确度和精密度选取市售某品牌奶粉试样,进行添加回收实验,结果见表3。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液,双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化,故判断该方法无基质效应的影响。
表3 0.10mg/Kg添加回收实验结果
5 检出限
本方法仪器最低检测浓度5ng/mL,按照上述样品前处理计算,本方法检出限0.01mg/kg。未检出样品以<0.01mg/kg报值。
“百家检坛”之乳品中双氰胺的检测:
http://www.woyaoce.cn/news/newsdetails.aspx?id=91350