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【极限体验】阿莫西林克拉维酸钾胶囊有关物质方法学

东风恶

2013/02/02

私聊

厂商论坛

3.2.P.5.3.2 有关物质

色谱图见附件8～234。

有关物质检查方法验证概要

项目	验证结果
流动相选择	流动相A为0.01mol／L磷酸二氢钾溶液（用2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0），流动相B为0.01mol／L磷酸二氢钾溶液（用2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）-乙腈（20:80）。
专属性	各破坏条件下，产生的杂质与主成分能够有效分离，主成分峰未检出不纯物。
线性和范围	无相关研究内容。
定量限、检测限	阿莫西林以17.9分钟±1分钟基线计算信噪比，当S/N≒3时,检测限为1.48ng（浓度为0.074µg/ml），当S/N≒10时,定量限为4.92ng（浓度为0.246µg/ml）；克拉维酸以6.3分钟±1分钟基线计算信噪比，当S/N≒3时,检测限为1.27ng（浓度为0.063µg/ml）,当S/N≒10时,定量限为4.22ng（浓度为0.211µg/ml）。
准确度	无相关研究内容。
精密度	自身对照溶液连续进样6次，阿莫西林和克拉维酸峰面积和保留时间精密度RSD均小于0.5%
溶液稳定性	本品供试品溶液室温放置8小时稳定性较好，阿莫西林和克拉维酸钾主峰面积的RSD值和归一化含量RSD值均小于2.0%；当室温放置8小时后，杂质个数和杂质含量没有明显变化。
耐用性	磷酸盐pH值在5.5～6.0，检测波长230±2nm，流速、柱温耐用范围较宽。

3.2.P.5.3.2.1 流动相选择（色谱图见附件8～10）

参照中国药典2012年版二部收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂有关物质项和新药转正标准第75册收载的阿莫西林克拉维酸钾胶囊质量标准WS₁-(X-024)-2007Z有关物质项，流动相体系采用流动相A为0.01mol／L磷酸二氢钾溶液（用2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0），流动相B为0.01mol／L磷酸二氢钾溶液（用2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）-乙腈（20:80）。

根据初步拟订的流动相体系进行梯度洗脱选择试验，试验结果统计见下表图。

梯度洗脱方式（一）

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
t_R + 0	98	2
t_R + 20	70	30
t_R + 22	98	2
t_R + 32	98	2

梯度洗脱方式（二）

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
0	95	5
0.5	95	5
30.5	59	41
32	95	5
40	95	5

备注：梯度洗脱方式（一）参考中国药典2010年版（二部）收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准；

梯度洗脱方式（二）参考新药转正标准第75册收载的阿莫西林克拉维酸钾胶囊质量标准WS1-(X-024)-2007Z。

流动相选择试验结果

编号	项目	保留时间（min）	拖尾因子	前/后峰分离度	理论板数	备注
1.	克拉维酸	5.689	3.226	10.491/3.976	2197	梯度洗脱方式（一）
1.	阿莫西林	17.390	2.180	18.500/28.278	8089	梯度洗脱方式（一）
2.	克拉维酸	3.991	2.278	8.434/2.113	2999	梯度洗脱方式（二）
2.	阿莫西林	7.108	0.619	12.071/15.620	15981	梯度洗脱方式（二）
3.	克拉维酸	5.896	2.324	1.893/4.169	4539	梯度洗脱方式（一），阿莫西林克拉维酸钾系统适用性溶液
3.	阿莫西林	17.715	1.116	9.157/9.559	12318	梯度洗脱方式（一），阿莫西林克拉维酸钾系统适用性溶液

试验结果典型色谱图：

梯度洗脱方式（一）试验结果表

峰#	保留时间	面积	高度	面积%	分离度	拖尾因子	理论塔板#
1	2.486	60786	13028	0.1674	--	1.257	6323.810
2	5.689	4837765	287075	13.3259	10.491	3.226	2197.460
3	7.287	43611	3637	0.1201	3.976	0.995	8359.856
4	17.390	31074044	1075377	85.5951	18.500	2.180	8089.375
5	30.823	72372	10926	0.1994	28.278	1.057	487118.919
6	32.892	17985	2492	0.0495	12.225	2.153	660669.684
7	34.688	13444	1603	0.0370	10.194	1.387	530955.536
8	35.201	25749	3158	0.0709	2.508	0.980	415064.916
9	35.465	82474	13215	0.2272	1.375	1.066	729717.857
10	36.992	28985	4531	0.0798	9.101	1.083	761338.657
11	37.210	14670	1945	0.0404	1.123	1.514	464803.126
12	37.631	13522	1910	0.0372	2.147	1.533	755129.394
13	38.218	18108	2467	0.0499	3.273	1.213	678294.893

2.梯度洗脱方式（二）色谱图

梯度洗脱方式（二）试验结果表

峰#	保留时间	面积	高度	面积%	分离度	拖尾因子	理论塔板#
1	2.396	70204	14052	0.2263	--	1.260	5356.764
2	3.536	22213	4102	0.0716	8.434	1.490	10282.721
3	3.991	4722251	454222	15.2221	2.113	2.278	2999.439
4	7.108	25843956	1998396	83.3078	12.071	0.619	15981.306
5	10.314	93623	13114	0.3018	15.620	1.126	49414.703
6	11.438	14464	1640	0.0466	5.789	1.682	51084.560
7	12.295	22616	2732	0.0729	4.217	1.198	58013.073
8	12.846	13826	1975	0.0446	2.901	1.258	85431.287
9	14.665	10119	1409	0.0326	9.935	1.290	95028.741
10	14.961	90552	13302	0.2919	1.597	1.025	108581.287
11	16.729	33026	4621	0.1065	9.589	1.175	128089.462
12	16.978	19693	3281	0.0635	1.422	1.182	172732.652
13	17.508	12467	1918	0.0402	3.157	1.163	164978.729
14	25.930	29720	3068	0.0958	39.812	1.301	171190.507
15	29.724	13496	1058	0.0435	14.033	1.375	168014.637
16	32.588	10033	1313	0.0323	11.558	1.040	402421.620

3.梯度洗脱方式（一）阿莫西林克拉维酸钾系统适用性对照品色谱图

梯度洗脱方式（一）阿莫西林克拉维酸钾系统适用性对照品试验结果表

峰#	保留时间	面积	高度	面积%	分离度	拖尾因子	理论塔板#
1	2.964	21439	2579	0.1508	--	1.094	3395.986
2	5.371	389797	50045	2.7426	11.799	1.087	11026.214
3	5.896	2107428	170019	14.8278	1.893	2.324	4539.717
4	7.255	1510237	133174	10.6260	4.169	1.328	9235.805
5	13.108	10481	772	0.0737	17.475	1.139	20319.676
6	17.715	3912953	160110	27.5314	9.157	1.116	12318.531
7	24.277	26440	989	0.1860	9.559	1.044	17478.699
8	26.380	59371	3686	0.4177	3.619	0.955	60813.166
9	27.993	915721	105879	6.4430	4.966	1.105	255506.176
10	28.349	28333	2740	0.1994	0.523	-	9899.258
11	28.676	113138	13057	0.7960	0.468	-	196688.306
12	28.921	320742	18451	2.2567	0.757	-	88122.596
13	29.385	201574	19724	1.4183	1.498	-	262227.283
14	29.975	72838	3511	0.5125	1.444	1.572	41664.543
15	30.926	20615	2554	0.1450	2.477	2.128	468652.257
16	31.622	32844	1973	0.2311	2.170	0.865	75230.319
17	32.105	176405	28939	1.2412	1.550	0.973	631905.752
18	32.356	366618	59054	2.5795	1.542	1.193	625701.788
19	32.701	40439	7137	0.2845	2.216	0.894	778326.980
20	33.282	1887682	246247	13.2817	3.264	1.440	412080.833
21	34.193	12202	1879	0.0859	5.332	0.708	1034079.814
22	34.509	447826	44332	3.1509	1.790	-	399649.798
23	34.740	45865	6248	0.3227	0.990	-	314086.523
24	35.100	21272	3377	0.1497	1.713	1.041	666685.150
25	35.362	1121816	174619	7.8931	1.532	1.151	691473.561
26	35.925	38560	5102	0.2713	3.357	1.598	754056.359
27	36.526	10241	1775	0.0721	3.725	0.892	864169.567
28	36.720	10145	2109	0.0714	1.356	0.851	1289084.363
29	36.930	151940	24732	1.0690	1.430	0.946	808191.334
30	37.128	51837	9398	0.3647	1.260	1.176	973129.284
31	37.605	52427	4153	0.3689	1.837	0.747	166983.281
32	38.129	22784	3711	0.1603	1.955	1.029	821709.654
33	38.920	10662	1791	0.0750	4.825	0.987	949702.610

试验结果显示，采用梯度洗脱方式（二）克拉维酸主峰出峰时间较短，不利于洗脱出主峰附近的杂质，采用梯度洗脱方式（一）克拉维酸和阿莫西林主峰保留时间适当，有利于检出主峰附近的杂质，阿莫西林克拉维酸钾有关物质系统适用性试验对照品色谱图中各杂质均有良好的分离度，采用梯度洗脱方式（一）有利于阿莫西林克拉维酸钾胶囊的有关物质。初步拟订梯度洗脱方式（一）作为本品有关物质检查的梯度洗脱方式。
3.2.P.5.3.2.2方法专属性(色谱图见附件11～155)

此处省略3000字。

3.2.P.5.3.2.3本品中试样品和上市品杂质谱比较

3.2.P.5.3.2.4有关物质检查波长选定

用二极管阵列检测器对阿莫西林和克拉维酸进行光谱扫描，在200nm～230nm波长处克拉维酸有较强的紫外吸收，在200nm～300nm波长处阿莫西林有较强的紫外吸收，其主要杂质的紫外光谱图显示在210～230nm有较强的紫外吸收、专属性试验样品在230nm±2nm检出杂质个数较多。典型色谱图见下图。

本品目前在中国药典、美国药典、日抗基和英国药典均未收载。参照新药转正标准第75册收载的阿莫西林克拉维酸钾胶囊质量标准WS₁-(X-024)-2007Z（有关物质检查项，254nm）、中国药典2010年版（二部）收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准（有关物质检查项，230nm）和专属性试验结果，将波长定为230nm。

3.2.P.5.3.2.5检测限与定量限(色谱图见附件196～201)

精密称取阿莫西林克拉维酸钾对照品59.2mg，置20ml量瓶中，加0.01mol/L磷酸二氢钾（用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml置100ml，加0.01mol/L磷酸二氢钾（用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）稀释至刻度，作为储备液，并逐级稀释，分别取20µl注入高效液相色谱仪，经测定，阿莫西林和克拉维酸主峰的保留时间分别约为6.3分钟和18.0分钟,在主峰保留时间±1.0分钟范围分别以阿莫西林和克拉维酸主峰峰高计算基线噪音。

试验结果显示，以溶剂基线噪音计算信噪比，基线噪音约为0.035 mAV（推算出检测限峰高为0.105 mAV），阿莫西林以17.9分钟±1分钟基线计算信噪比，当S/N≒3时,检测限为1.48ng（浓度为0.074µg/ml），当S/N≒10时,定量限为4.92ng（浓度为0.246µg/ml）；克拉维酸以6.3分钟±1分钟基线计算信噪比，当S/N≒3时, 检测限为1.27ng（浓度为0.063µg/ml）,当S/N≒10时,定量限为4.22ng（浓度为0.211µg/ml）。试验结果见下表。

阿莫西林和克拉维酸检测限的确定

序号

峰高（mAV）

εmax

峰高（mAV）

εmin

峰高（mAV）

Δε

平均峰高（mAV）

Δε

检测限（mAV）

0.0375

0.0025

0.035

0.105

阿莫西林检测限验证浓度

序号	浓度(µg/ml)	峰高（mAV） εmax	峰高（mAV） εmin	峰高（mAV）	信噪比
1	40.966	41.630	0.095	41.535	1186.7
2	4.097	3.768	-0.0425	3.810	108.8
3	0.819	0.812	0.0065	0.805	23.0
4	0.246	0.225	-0.013	0.238	6.8
5	0.074	0.195	0.120	0.075	2.1

克拉维酸检测限验证浓度

序号	浓度(µg/ml)	峰高（mAV） εmax	峰高（mAV） εmin	峰高（mAV）	信噪比
1	10.538	21.888	0.0125	21.876	625.0
2	1.054	2.038	-0.0135	2.0515	58.6
3	0.211	0.4078	-0.025	0.4328	12.4
4	0.063	0.142	-0.0025	0.1445	4.1

3.2.P.5.3.2.6进样精密度试验(色谱图见附件202～207)

精密称取本品（规格：156.25mg，批号：20120401）内容物细粉0.0848g置20ml量瓶中，加0.01mol/L磷酸二氢钾（用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）适量冰浴超声15min使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液2ml置100ml量瓶中，加0.01mol/L磷酸二氢钾（用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）稀释至刻度，精密量取20µl注入液相色谱仪并记录色谱图，连续测定6次，试验结果见下表。

2%自身对照溶液精密度试验结果

项目	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD
阿莫西林峰面积	618694	617266	615735	615642	616373	616498	616701	0.2%
阿莫西林保留时间	17.810	17.803	17.811	17.790	17.808	17.819	17.807	0.1%
克拉维酸峰面积	98895	98469	98142	98184	98568	98754	98502	0.3%
克拉维酸保留时间	6.116	6.109	6.129	6.118	6.115	6.117	6.117	0.1%

进样精密度试验结果表明，2%自身对照溶液连续进样6次，阿莫西林和克拉维酸峰面积和保留时间精密度RSD均小于0.5%，能满足本品有关物质检查要求。

3.2.P.5.3.2.7溶液稳定性试验(色谱图见附件208～212)

精密称取本品（规格：156.25mg，批号：20120401）内容物细粉84.6mg，置20ml量瓶中，加0.01mol/L磷酸二氢钾（用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）适量冰浴超声15min使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试溶液，在室温条件下放置8小时，分别于0、2、4、6、8小时，取上述溶液各20µl，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见下表。

溶液中的阿莫西林稳定性试验结果

时间（h）	0	2	4	6	8	平均值	RSD
阿莫西林峰面积	30724639	30673074	30671435	30624787	30579965	30654780	0.18%
归一化含量（%）	86.232	86.101	86.117	86.110	85.583	86.029	0.30%

溶液中的克拉维酸钾稳定性试验结果

时间（h）	0	2	4	6	8	平均值	RSD
克拉维酸钾峰面积	4513046	4505865	4502275	4489002	4475272	4497092	0.33%
归一化含量（%）	12.666	12.648	12.641	12.622	12.525	12.620	0.44%

溶液稳定性试验结果表明，本品在溶剂中室温放置8小时稳定性较好，阿莫西林和克拉维酸钾主峰面积的RSD值和归一化含量RSD值均小于2.0%；当室温放置8小时，杂质个数和杂质含量没有明显变化，表明本品的流动相溶液室温放置8小时较稳定。

3.2.P.5.3.2.8有关物质测定方法的确定

通过专属性试验、检测限与定量限、1%自身对照精密度试验、溶液稳定性试验，拟订本品有关物质测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。

取本品的内容物适量，精密称定，加流动相A溶解（必要时冰浴超声助溶）并稀释制成每1ml中含阿莫西林2mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取适量，用流动相A定量稀释制成每1ml中含阿莫西林40μg的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法（附录Ⅴ D）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶（A型）为填充剂；流动相A为0.01mol／L磷酸二氢钾溶液（用2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0），流动相B为0.01mol／L磷酸二氢钾溶液（用2mol／L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0）-乙腈（20:80）；检测波长为230nm；先以流动相A-流动相B（98:2）等度洗脱，待阿莫西林峰洗脱完毕后立即按下表进行线性梯度洗脱，t_R为阿莫西林主峰的保留时间。取阿莫西林克拉维酸系统适用性试验对照品，加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含2.5mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录的色谱图应与标准图谱一致。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使阿莫西林峰的峰高约为满量程的25％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液两个主峰面积和的1.25倍（2.5％），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液两个主峰面积和的3.5倍（7.0％），供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液两个主峰面积和0.05倍的峰可忽略不计。

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
t_R + 0	98	2
t_R + 20	70	30
t_R + 22	98	2
t_R + 32	98	2

3.2.P.5.3.2.9耐用性(色谱图见附件213～230)

耐用性研究项目	试验方法的条件	确认的耐用性范围
流速（活性成分的保留时间变化）	0.8～1.2ml/min	1.0±0.2ml/min
色谱柱温度	室温	20℃～30℃
缓冲盐pH值变化	pH值5.5～6.5	pH值5.5～6.0
检测波长	220nm～240nm	230±2nm

申报质量标准条件色谱图见附件214。

（1）流速变化±0.2ml/min，试验结果见下图表。

试验结果色谱图（1.0±0.2ml/min）（色谱图见附件214～218）

3.2.P.5.3.2.9耐用性(色谱图见附件213～230)

耐用性研究项目	试验方法的条件	确认的耐用性范围
流速（活性成分的保留时间变化）	0.8～1.2ml/min	1.0±0.2ml/min
色谱柱温度	室温	20℃～30℃
缓冲盐pH值变化	pH值5.5～6.5	pH值5.5～6.0
检测波长	220nm～240nm	230±2nm