继”阿莫西林克拉维酸钾胶囊有关物质方法学”项目结束，整理的含量测定方法学。
项目：含量测定（3.2.P.5.2.9）
检查方法：照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定
试验条件：
仪器：LC-2010CHT (SHIMADZU)
万分之一电子天平（Sartorius ABS-124S型）
工作站（LCsolution色谱工作站)
色谱柱（填料：C18，规格：250mm×4.6mm，填料粒径：5μm）
Xtimate C18 4.6*250 ，PN:Xt5B18425 ，SN:411101950
UV检测器（检测波长：220nm）
柱温：室温
流动相：0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）。
流速：1.0ml/min。
运行时间：约20分钟。
系统适用性：取阿莫西林克拉维酸系统适用性试验对照品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.8mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录的色谱图应与标准图谱一致。
具体试验操作：
取装量差异项下的内容物适量，精密称取适量，加水适量，超声使溶解并定量稀释制成每1ml中含阿莫西林0.5mg的溶液，滤过，立即精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另分别精密称取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含阿莫西林0.5mg和每1ml中含克拉维酸0.125mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。
计算公式：
标示量百分含量（%）=××100%
式中：Cs为对照品的浓度（mg/ml）；
At为供试液的主峰面积；
Nt为供试液的稀释倍数；
AS为对照品溶液的主峰面积；
W为供试品取样量（mg）。
“色”路蹒跚，藤下葡萄，某品种含量测定方法学之耐用性试验部分路蹒跚，藤下葡萄，某品种含量测定方法学之耐用性试验部分
3.2.P.5.3.6.1波长选择
本品含量测定检测波长参照中国药典2010年版二部收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准含量测定项，即220nm。
3.2.P.5.3.6.2流动相选择(色谱图见附件1122～1124)
参照中国药典2010年版二部收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准含量测定项，以0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）为流动相。
试验过程：
系统适用性试验供试液：精密称取阿莫西林克拉维酸钾系统适用性对照品4.2mg至5ml量瓶中，加流动相适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液；
对照品溶液：精密称取阿莫西林对照品29.1mg和克拉维酸钾对照品7.3mg至50ml量瓶中，加水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试液；
精密量取上述供试液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，典型色谱图见下图：
3.2.P.5.3.6.3进样精密度试验(色谱图见附件1125～1130)
精密称取阿莫西林对照品0.0291g和克拉维酸对照品0.0073g，置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试液，取供试液20μl注入液相色谱仪，重复进针6次并记录色谱图。试验结果见下表。
精密度试验结果
进针次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD% |
阿莫西林保留时间（min） | 11.580 | 11.581 | 11.581 | 11.582 | 11.569 | 11.569 | 0.05 |
阿莫西林峰面积 | 15577361 | 15534713 | 15555607 | 15571737 | 15570852 | 15570850 | 0.10 |
克拉维酸保留时间（min） | 6.497 | 6.501 | 6.502 | 6.504 | 6.500 | 6.500 | 0.04 |
克拉维酸峰面积 | 5633160 | 5633461 | 5632872 | 5634096 | 5633504 | 5632704 | 0.01 |
试验结果表明，连续测量6次，主峰保留时间和峰面积RSD%均小于2.0%，进样精密度符合要求。
3.2.P.5.3.6.4含量测定线性关系试验(色谱图见附件1131～1135)
精密称取阿莫西林对照品0.0291g和克拉维酸对照品0.0073g，置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试液，分别精密量取12μl、16μl、20μl、24μl、28μl注入液相色谱仪并记录色谱图。试验结果见下表。
阿莫西林线性关系试验结果
百分比 | 60% | 80% | 100% | 120% | 140% |
注入量（μg） | 5.99 | 7.99 | 9.99 | 11.98 | 13.98 |
峰面积（A） | 9346977 | 12432019 | 15562826 | 18616263 | 21723755 |
克拉维酸线性关系试验结果
百分比 | 60% | 80% | 100% | 120% | 140% |
注入量（μg） | 1.66 | 2.22 | 2.77 | 3.33 | 3.88 |
峰面积（A） | 3388438 | 4500733 | 5625020 | 6722121 | 7829137 |
试验结果经线性回归分析，阿莫西林在5.99μg～13.98μg，直线方程为y=1548884.9368x+67468.0000，R2=1.0000，相关系数r=1.0000，截距为67468，小于100%阿莫西林峰面积的±2.0%（311257），表明线性关系试验符合要求；克拉维酸在1.66μg～3.88μg，直线方程为y=2000477.1001x+67767.2784，R2=1.0000，相关系数r=1.0000，，截距为67767，小于100%克拉维酸峰面积的±2.0%（112500），表明线性关系试验符合要求。
3.2.P.5.3.6.5溶液稳定性试验(色谱图见附件1136～1140)
取本品（规格：156.25mg，批号：20120401）细粉0.0502g，置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液在室温条件下放置8h，分别于0、2、4、6、8h精密量取上述溶液各20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。
溶液中阿莫西林稳定性试验结果
放置时间（h）/峰面积 |
0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 平均值 | RSD |
15327048 | 15335390 | 15322633 | 15308883 | 15303426 | 15319476 | 0.09% |
溶液中克拉维酸稳定性试验结果
放置时间（h）/峰面积 |
0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 平均值 | RSD |
4753206 | 4755771 | 4745247 | 4736974 | 4729554 | 4741950 | 0.19% |
本品供试液在室温条件下置8个小时，测得阿莫西林和克拉维酸的主峰面积的RSD%值均小于2.0%，试验结果表明阿莫西林和克拉维酸在水溶液中较稳定。
3.2.P.5.3.6.6回收率试验(色谱图见附件1141～1162)
按80%、100%、120%的份量，各精密称取阿莫西林和克拉维酸对照品三份，按处方量加入混合辅料约0.060g，混匀，分别用水适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，制成浓度各含阿莫西林约为0.40mg/ml、0.50mg/ml、0.60mg/ml的供试品溶液，精密量取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。
阿莫西林回收率试验测定结果
标示量 | 对照品含量 | 加入量(g) | 测得量(g) | 回收率(%) | 平均值（%） | RSD（%） |
80% | 工作对照品阿莫西林含量为69.2%，克拉维酸为17.8% | 0.1122 | 0.0762 | 98.1 | 100.0 | 1.06 |
0.1112 | 0.0775 | 100.7 |
0.1117 | 0.0781 | 101.0 |
100% | 0.1397 | 0.0962 | 99.5 |
0.1402 | 0.0974 | 100.4 |
0.1415 | 0.0972 | 99.3 |
120% | 0.1662 | 0.1167 | 101.5 |
0.1698 | 0.1165 | 99.1 |
0.1686 | 0.1167 | 100.0 |
试验结果表明，平均回收率为100.0%，在98.0%～102.0%范围内，n=9，RSD为1.06%，小于2.0%，回收率符合含量测定方法验证要求。
克拉维酸回收率试验测定结果
标示量 | 对照品含量 | 加入量(g) | 测得量(g) | 回收率(%) | 平均值（%） | RSD（%） |
80% | 工作对照品阿莫西林含量为69.2%，克拉维酸为17.8% | 0.1122 | 0.0199 | 99.8 | 100.5 | 1.00 |
0.1112 | 0.0200 | 101.0 |
0.1117 | 0.0202 | 101.8 |
100% | 0.1397 | 0.0249 | 100.1 |
0.1402 | 0.0254 | 101.6 |
0.1415 | 0.0251 | 99.8 |
120% | 0.1662 | 0.0300 | 101.5 |
0.1698 | 0.0299 | 98.9 |
0.1686 | 0.0300 | 99.9 |
试验结果表明，平均回收率为100.5%，在98.0%～102.0%范围内，n=9，RSD为1.00%，小于2.0%，回收率符合含量测定方法验证要求。
3.2.P.5.3.6.7重复性试验(色谱图见附件1141～1144、1163～1174)
精密称取本品（规格：156.25mg，批号：20120401）细粉6份，分别置50ml量瓶中，用水适量超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过，制成每1ml含阿莫西林0.5mg的供试液，精密量取续滤液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表。
重复性试验结果（%）
成分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD |
阿莫西林 | 99.3 | 99.6 | 99.9 | 100.0 | 100.5 | 100.1 | 99.9 | 0.4 |
克拉维酸 | 103.2 | 101.3 | 103.8 | 101.8 | 102.4 | 102.0 | 102.4 | 0.9 |
试验结果表明，重复性试验结果在99.3%～103.8%，RSD%值均小于1.0%，符合重复性试验要求。
3.2.P.5.3.6.8耐用性(色谱图见附件1175～1254)
耐用性研究项目
|
试验方法的条件
|
确认的耐用性范围
|
流速（活性成分的保留时间变化）
|
1.0ml/min
|
±0.2ml/min
|
pH值变化
|
4.4±0.1
|
3.9～4.9
|
流动相成分比例变化
|
甲醇比例为5%
|
2%～10%
|
检测波长变化
|
220nm
|
210nm～230nm
|
柱温变化
|
室温
|
20℃～30℃
|
申报质量标准中有关物质检查项色谱条件。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）为流动相；检测波长为220nm。
（1）流速0.8ml/min～1.2ml/min，试验结果见下图表（色谱图见附件1175～1190）。
3.2.P.5.3.6.9含量测定方法的确定
根据含量方法学试验结果并参照新药转正标准第75册收载的阿莫西林克拉维酸钾胶囊质量标准WS1-(X-024)-2007Z和中国药典2010年版二部收载的阿莫西林克拉维酸钾相关制剂质量标准，确定本品含量测定方法如下：
照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol／L磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml使溶解，用10％磷酸溶液或氢氧化钠试液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml）-甲醇（95:5）为流动相；检测波长为220nm。取阿莫西林克拉维酸钾系统适用性试验对照品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.8mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录的色谱图应与标准图谱一致。
测定法 取装量差异项下的内容物适量，精密称取适量，加水适量，超声使溶解并定量稀释制成每1ml中含阿莫西林0.5mg的溶液，滤过，立即精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另分别精密称取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成与供试品溶液浓度相同的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。
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