“色”路蹒跚，不拘一格，头孢呋辛酯干混悬剂有关物质流动相摸索部分

东风恶

2013/07/02

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“色”路蹒跚，不拘一格，头孢呋辛酯干混悬剂有关物质流动相摸索部分。

我主要工作是仿6，在遇到国家标准，我一般持研究态度，因为仿制药提倡的是仿制其质量而不是标准，一般会进行些比较。

例如该品种在中国药典2010年班二部有收载，用的是等度洗脱方式，在进行研究的时候，发现梯度洗脱更具优势，所以就改变了系统方式。

其具体研究方式如下：

6.4 有关物质

6.4.1方法的选择

参照中国药典2005年版二部收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS₁-(X-391)-2004Z有关物质检查项，本品选择高效液相色谱法作为有关物质检测方法。

6.4.2方法学验证

6.4.2.1 试验材料

仪器：LC-10AT、20AT VP泵(SHIMADZU CORPORATION)

SPD-10A、20A、M20A VP紫外检测器(SHIMADZUCORPORATION)

工作站：LC solution(SHIMADZU CORPORATION)

色谱柱：C₁₈色谱柱，粒度5um，规格250mm×4.6mm，wel518425，LN:W1801.19，SN:1021096.

主要试剂：甲醇(色谱纯)、磷酸二氢铵（分析纯）、

6.4.2.2 波长选择

根据专属性试验结果并参照中国药典2010年版（二部）收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS₁-(X-391)-2004Z有关物质检查项，本品选择高效液相色谱法作为有关物质检测方法。波长选择为278nm。

6.4.2.3 流动相选择

参照中国药典2010年版（二部）收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS₁-(X-391)-2004Z有关物质检查项

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速为每分钟1.0ml，检测波长278nm，进样量20μl。

6.4.2.3.1 等度洗脱

流动相配制：

①0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（60:40）；

②0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（50:50）；

③0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（55:45）。

供试样品配制：

称取头孢呋辛酯对照品适量（约相当于头孢呋辛11mg），置20ml量瓶中，加2ml甲醇超声溶解，分别用相应的流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取20μl注入液相色谱仪并记录色谱图。试验结果见表10-6，色谱图见图37～39。

表10-6等度洗脱试验结果

流动相	异构体	保留时间（min.）	拖尾因子	与相邻峰分离度	理论板数	出峰个数
①	异构体B	15.757	0.992	2.189	4871	11
	异构体A	18.688	0.967	3.030	5249
	△³-异构体	21.285	0.984	1.939	2671
②	异构体B	4.952	1.063	1.448	3808	13
	异构体A	5.446	1.019	1.482	3994
	△³-异构体	5.903	-	0.419	165
③	异构体B	8.094	1.011	13.739	4361	9
	异构体A	9.247	0.990	2.239	4690
	△³-异构体	10.314	1.104	1.579	2590

试验结果表明流动相①、流动相③分离度大于1.5，较流动相②好；流动相①洗脱出峰个数较流动相③多2个；流动相①、流动相③异构体出峰时间较较流动相②理想。综上初步拟订以流动相①0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（60:40）为有关物质检查的流动相。

典型色谱图：

6.4.2.3.2 梯度洗脱

由于本品为头孢类抗生素，杂质个数可能较多，初步拟选用梯度洗脱方式对本品有关物质进行探索研究。

流动相配制：流动相A: 0.2mol/L磷酸二氢铵溶液，流动相B：甲醇。

根据6.4.2.3.1 等度洗脱试验结果，拟定梯度洗脱流动相A、B初始浓度比例60:40，由于异构体A、B出峰时间约为20分钟，△³-异构体分离度分离度较小，在梯度洗脱流动相A、B初始浓度比例60:40保持在20分钟以后进行比例变化，梯度洗脱程序见表10-7。

表10-7 梯度洗脱程序

梯度	时间（min.）	流动相A(%)	流动相B(%)
①	0	60	40
	35	60	40
	40	40	60
	45	60	40
	60	60	40
②	0	60	40
	20	60	40
	40	40	60
	45	60	40
	60	60	40

供试液配制：

溶剂：0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（60:40）

①称取头孢呋辛酯对照品0.0124g，置20ml量瓶中，加2ml甲醇超声溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取20μl注入液相色谱仪，以梯度①进行洗脱并记录色谱图。

②称取头孢呋辛酯对照品0.0127g，置20ml量瓶中，加2ml甲醇超声溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取20μl注入液相色谱仪，以梯度②进行洗脱并记录色谱图。

③称取本品（规格：0125g，批号：20100301）经紫外光照射24h细粉0.0391g，置20ml量瓶中，加2ml甲醇超声溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为系统适应性溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，以梯度②进行洗脱并记录色谱图。

④称取头孢呋辛酯对照品0.00470g，置20ml量瓶中，加2ml甲醇超声溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液水浴60℃加热1h，放冷，作为系统适应性溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，以梯度②进行洗脱并记录色谱图。

试验结果见表10-8，色谱图见图40～46。

表10-8梯度洗脱试验结果

供试液	异构体	保留时间（min.）	拖尾因子	与相邻峰分离度	理论板数	出峰个数
①	异构体B	14.421	1.000	2.213	4841	14
	异构体A	16.995	0.975	2.917	5281
	△³-异构体	19.327	1.024	1.890	2544
②	异构体B	14.376	1.001	2.152	4838	19
	异构体A	16.944	0.975	2.912	5237
	△³-异构体	19.296	0.999	1.879	2428
③	异构体B	14.413	1.001	4.698	4842	18
	异构体A	16.984	0.978	2.915	5274
	△³-异构体	19.346	0.977	1.854	2301
④	异构体B	14.236	1.025	2.044	4880	21
	异构体A	16.742	1.011	2.895	5342
	△³-异构体	19.057	1.003	1.843	2282

试验结果表明梯度①基线较梯度②漂移幅度大；梯度①在30分钟和50分钟时间处洗脱出的杂质分离度较梯度②差；梯度①较梯度②洗脱出的杂质个数少5个；紫外破坏和高温破坏系统适应性溶液均能符合要求。综上初步拟订以流动相A: 0.2mol/L磷酸二氢铵溶液，流动相B：甲醇以梯度②进行有关物质检查。

6.4.2.4初步拟定有关物质检查方法

参照中国药典2005年版二部收载的头孢呋辛酯原料药质量标准、美国药典USP32-NF27收载的头孢呋辛酯混悬剂质量标准和新药转正标准第60册收载的头孢呋辛酯干混悬剂质量标准WS₁-(X-391)-2004Z有关物质检查项，初步拟定有关物质检查方法如下：

取本品细粉适量，精密称定(约相当于头孢呋辛50mg)，置100ml量瓶中，加甲醇10ml溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2mol/L磷酸二氢铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱，检测波长为278nm，流速为每分钟1.0ml。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使两主成分中任一主成分色谱峰的峰高为满量程的20%～25%。取头孢呋辛酯对照品适量，加甲醇溶解，用流动相稀释制成每1ml中约含头孢呋辛0.2mg的溶液，摇匀，量取适量，于60℃水浴中加热至少1小时，放冷至室温，得含△³-异构体溶液；取经紫外光照射24小时的本品适量，精密称定，加甲醇适量溶解，用流动相稀释制成每1ml中约含头孢呋辛0.2mg的溶液，作为含头孢呋辛酯E异构体的溶液。分别取上述溶液20μl，分别注入液相色谱仪，头孢呋辛酯A、B异构体、△³-异构体及E异构体峰的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1，头孢呋辛酯A、B异构体之间、头孢呋辛酯△³-异构体之间的分离度均应符合要求。立即精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，两个E异构体峰面积之和不得大于对照溶液两个主峰面积之和的1.5倍（1.5%），Δ³-异构体峰面积不得大于对照溶液两个主峰面积之和的2倍（2.0%），其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液两个主峰面积之和（1.0%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液两个主峰面积之和的4.5倍（4.5%）（供试品溶液中任何小于对照溶液两个主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计）。

线性梯度洗脱程序