不同液－液萃取条件萃取“瘦肉精”效果的对比

β-兴奋剂在酸性条件下溶于水，碱性条件下溶于有机溶剂，溶剂萃取时通常结合其溶解性能进行考察。β-兴奋剂为中等极性的疏水性物质，呈弱碱性(苯胺型)或酸碱两性(苯酚型)。苯胺型的易溶于乙酸乙酯等有机溶剂，而苯酚型的则易溶于异丙醇等极性有机溶剂。为了提取酸性水溶液中成盐的β-兴奋剂，可先调节pH至碱性，使药物呈游离状态。同时加入一些无水盐类粉末来饱和其中的水相，然后再用乙酸乙酯-异丙醇 (6:4，V/V)混合溶剂提取待测物，结果较为满意^[1]

用于SAL的液－液萃取法萃取剂^[2]有乙腈、乙醚、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙酸乙酯－异丙醇、乙酸乙酯－丁醇等。另有文献报道，Wu等^[3]采用乙酸乙酯萃取、电化学检测RAC和CLB，另有综述^[4]提到：臧勇军等用乙腈－盐酸溶液两次提取肉样，正己烷脱脂，氯仿－氢氧化钠溶液提取莱克多巴胺和克伦特罗，离心后蒸干，甲醇定容后进行 LC－MS分析；康笑枫等采用乙酸铵提取肉样中的克伦特罗，正己烷脱脂后衍生化，进行 gc－MS 分析；张素霞等用甲醇－水提取饲料中的莱克多巴胺，分别经正己烷和二氯甲烷净化后，利用高效液相色谱荧光法进行检测。Chen等^[5]采用丙醇萃取饲料中的CLB、CIM和SAL，高燕红等用丙酮提取饲料中的莱克多巴胺和克伦特罗；郑举等用盐酸溶液超声振荡提取饲料中的克伦特罗，提取液调至碱性后，用甲苯－二氯甲烷萃取，萃取液离心，蒸干后用甲醇定容，然后进行液相色谱分析。王建平等在碱性条件下用异丁醇提取猪尿中的莱克多巴胺，并用酶联免疫法检测。Henze 等用乙酸钠缓冲体系处理样品，在碱性条件下用叔丁基甲基醚和叔丁醇提取尿液中的非诺特罗、奥西那林、睿珀特罗、特布他林。邓光辉^[6]、Kramer 等在超声振荡下，用乙腈作为提取溶剂。王伟宇^[7][8]，Ying Chen^[5]等将猪饲料磨成粉状，加入乙醇－水(体积比为4：1)混合溶液l0 mL，超声萃取猪饲料中的β-兴奋剂。

另外还有采用乙酸乙酯和叔丁基甲醚分两次萃取，或者采用混合溶剂如异丙醇/乙酸乙酯（60:40，体积/体积）^[9]、叔丁基甲醚-异丙醇( 5:1)^[9]，郑妍鹏等^[10]采用乙醇-乙醚萃取猪内脏中盐酸克伦特罗，采用毛细管电泳电导检测。

另外，对于复杂样品基质，脱脂选用正己烷^[6]，除蛋白可采用高氯酸，pH调节剂有氨水、N₂CO₃^[3]， NaOH^[9]等。加入某些碱性盐类可以调节溶液的酸碱性条件，同时也可以与待测药物竞争与水分子的结合，使萃取更容易进行。常用脱水剂（过饱和剂）有NaCl^[3]，无水Na₂SO₄^[6]等。固相萃取小柱中采用甲醇-氨水溶液使β-兴奋剂呈非解离态后洗脱，净化效果良好。

邓光辉等^[6]将猪肉剁碎，加入乙腈和无水硫酸钠超声波震荡萃取，再加入甲醇饱和正己烷震荡脱脂，采用毛细管电泳电化学法分离检测猪肉中的盐酸克伦特罗、特布他林和沙丁胺醇。

田苗等^[9]将猪组织(猪肉、猪肝、猪肾)用绞肉机绞碎，乙酸钠提取液加入高氯酸溶液除蛋白, 用5 mol /L NaOH溶液调 pH至 10.2。以氯化钠饱和水相, 加入 15 mL乙酸乙酯-异丙醇( 60:40)混合溶剂萃取, 在下层水相中加入 10 mL叔丁基甲醚-异丙醇(5:1) ,将上层有机溶剂与之前萃取液合并，旋转蒸干，然后用乙酸钠溶液溶解残渣, 测定。

上海安谱公司给出的萃取参考方法为30 mL乙腈、2mL异丙醇和10mL 0.1M柠檬酸钠缓冲液（pH2.5，含0.1M 氯化镁）提取目标物，加入异丙醇后旋转蒸发浓缩，液质联用检测。

浙江省地方标准（DB33/T 623—2006）适用于猪、牛、羊等动物尿液中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺等4种β-兴奋剂残留量的气相色谱-质谱法测定。试样加入内标物，用2 mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0后，过阳离子交换固相萃取柱，并依次用水5 mL、甲醇5 mL淋洗柱子，抽干；用4％氨水/乙酸乙酯溶液10 mL洗脱，收集洗脱液，经无水硫酸钠脱水，50℃氮气吹干；残余物中加乙酸乙酯5 mL，置于超声波清洗器中超声5 min，5000 r/min离心5 min，取上清液至5mL具塞玻璃试管中，50℃氮气吹干，与N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）进行衍生化反应，于气相色谱－质谱仪上进行测定。内标法定量。

超声波提取法是利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增强介质的穿透力以提取动物组织中残留物的方法。超声波使溶剂对细胞壁渗透力更大，强化细胞内外的质量传输; 同时破坏细胞壁，使细胞内含物更易释放。超声波空化可以产生微冲流，能有效打破边界层，使扩散速度加快，从而使萃取或浸出速度提高 2～10 倍。本文采用有机溶剂结合超声波震荡，对比了多种条件下的萃取效果。

1 实验部分

1.1仪器和试剂

P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国Beckman公司)；弹性无涂层石英毛细管柱，内径75 μm，长60.2 cm(有效分离长度为50 cm，美国Beckman公司)；纯水机（PURELAB Classic, ELGA Lab Water, UK），超声波清洗机（天津市瑞普电子仪器公司），pH计（丹佛仪器（北京）有限公司），瑞士梅特勒电子天平（梅特勒－托利多（上海）有限公司），高速离心机（美国Sigma公司）。

沙丁胺醇和克伦特罗购自中国药品生物制品检定所，莱克多巴胺、特布他林均购自德国（Dr. Ehrensterfer GmbH），西马特罗购于加拿大(Toronto Research Chemicals Inc.)，各标准品均按说明使用。模拟尿样来自健康志愿者。

1.2溶液的配制

制备0.l mol/L硼砂（Na₂B₄O₇）、5 mol/L NaOH、1 mol/L HCl储备液，取适量储备液、精确调节pH值并加入SDS配成所需的运行缓冲液。用超纯水配制五种β-兴奋剂标准品均为1.0 mg/mL浓度的储备液，低温避光保存；其他不同浓度的系列标准品溶液用运行缓冲溶液稀释得到。其它试剂均为分析纯。

1.3样品的预处理

采集的尿液应保存于4℃～8℃冰箱中，尿液应经离心处理，取上清液备用。

1.4毛细管电泳检测条件

按要求配制实验所需各种缓冲溶液，试液与运行缓冲液均经0.45 μm聚丙烯滤膜过滤，并经10000 r/min高速离心脱气5 min。每天电泳操作前毛细管均依次用甲醇-水(60：40)、0.1 mol/L NaOH、超纯水及运行缓冲液冲洗5 min。每次进样分析开始前, 均依次用0.1 mol/L NaOH，超纯水和对应的运行缓冲液冲洗5 min。分析过程中，样品分析一次以运行缓冲液冲洗一次，连续电泳分离最多3次后及时更换运行缓冲液，尽量保证两缓冲液瓶中缓冲液组分和高度一致，以保证分析的精度。本实验采用压力进样：20psi（Pounds per square inch）×5s，正极进样，负极柱上以二极管阵列(DAD)检测器190～600nm检测。采用了200 nm下吸收峰面积进行定量。

实验在恒温（25℃）、恒湿（相对湿度60%）的实验条件下进行。

1.5 实验过程及结果

分别准确量取试样5 mL至两个10 mL离心管中，其中一个加“瘦肉精”储备液10 μL作为加标后样本，彻底混匀，与空白对照平行检测。

由其基本信息表可以看出，五种盐类均为在碱性条件下解离，实验通过对比酸性和碱性条件下有机溶剂的萃取效果，初步证明，在酸性条件下萃取杂质较多，对检测干扰较大，五种物质在酸性条件下均较难回收，而在碱性条件下回收率比酸性条件下高，故采用碱性条件进行萃取。

实验对比了乙腈、甲醇、异丙醇、正丁醇、正己烷、异丙醇－乙酸乙酯等在弱碱性条件下直接萃取“瘦肉精”的结果，发现其他溶剂回收率较低或萃取得到杂质较多，一些溶剂虽然有较高的回收率，但是较难挥发，不容易浓缩样品，吹干时间明显延长。乙酸乙酯等的效果相对较好，进一步对比实验如下：

1.5.1 以两种不同盐饱和样本后萃取效果的对比

在尿液样品中加入两种不同的弱碱性盐类（Na₂CO₃和NaHCO₃）至过饱和；其加入量参照Na₂CO₃、NaHCO₃的溶解度表及溶解度曲线：

图－2 两种饱和条件下乙酸乙酯和正己烷三种不同比例的萃取剂萃取效果对比

图－3 Na₂CO₃饱和乙酸丁酯和乙酸乙酯萃取回收率对比

图－4 NaOH+Na₂SO₄或Na₂CO₃饱和萃取四种不同pH值下回收率对比

由上图可知，随着溶液pH值的上升，回收率呈逐步提高趋势，为此，进一步提高其pH值，并对比了两种饱和剂的效果，结果如下图所示：

图－5 5 NaOH+ Na₂CO₃或Na₂SO₄两种饱和剂在更高pH值下回收率对比

参考文献
[1] 王远, 邢丽杰, 郝家勇, 鲁立良, 唐宗贵, 罗小玲. 高效液相色谱-串联质谱法测定卤肉中 3 种β-受体激动剂残留的研究[J]. 食品科学, 2012,34(8): 216－219.
[2] 王国民, 李应国, 郗存显, 张进忠, 李正国. 动物组织中沙丁胺醇残留检测的样品前处理方法研究进展[J]. 食品工业科技, 2011,(4): 400-404.
[3] Wu C, Sun D, Li Q, Wu K. Electrochemical sensor for toxic ractopamine and clenbuterol based on the enhancement effect of graphene oxide[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2012,(168): 178-184.
[4] 许志刚, 练海贤, 李攻科, 胡玉玲. β2-兴奋剂的样品前处理与分析检测方法研究进展[J]. 分析测试学报, 2011,30(4): 465-472.
[5] Chen Y, Wang W, Duan J, Chen H, Chen G. Separation and Determination of Clenbuterol, Cimaterol and Salbutamol by Capillary Electrophoresis with Amperometric Detection[J]. Electroanalysis, 2005,17(8): 706-712.
[6] 邓光辉, 陈盛余, 高静, 王辉. 毛细管电泳电化学法分离检测盐酸克伦特罗、特布他林和沙丁胺醇[J]. 分析试验室, 2012,31(2): 25－28.
[7] 王伟宇, 张玉莲, 邢晓平, 王金妍, 石雪, 叶建农. 小型化毛细管电泳-电化学检测法测定猪尿和猪饲料中的β-兴奋剂[J]. 色谱, 2008,26(2): 228-231.
[8] Wang W, Zhang Y, Wang J, Shi X, Ye J. Determination of beta-agonists in pig feed, pig urine and pig liver using capillary electrophoresis with electrochemical detection[J]. Meat Sci, 2010,85(2): 302-305.
[9] 田苗. 猪组织中 10 种β-兴奋剂类兽药残留量的气相色谱-质谱法检测[J]. 分析测试学报, 2010,29(7): 712-716.
[10] 郑妍鹏, 曾红惠. 猪内脏中盐酸克伦特罗的毛细管电泳电导检测[J]. 中山大学学报: 自然科学版, 2002,41(5): 57-59.
[11] 王培龙, 范理, 宋荣, 高生, 苏晓鸥, 杨曙明. 动物尿液中盐酸克伦特罗的分子印迹固相萃取-气相色谱-质谱法研究[J]. 分析化学, 2007,35(9): 1319-1322.

液液萃取用的还是比较多的

嗯，感觉操作上来讲还是比较简单的，但是确实有些溶剂是有一定污染性的，做实验时应该注意！！

没有用新的萃取方法试试？

因为我的课题主要是别的方面，没有把重点放在萃取回收率的提高上……

应助达人

感觉文章的内容好复杂，有点看不懂

sorry,我的错……

其实就是萃取所用的溶剂、饱和用盐类、pH等条件……

支持楼上的说法，我很中意你呀哦