SPE-HPLC测定饲料中5种磺胺类药物
北京莱伯泰科仪器股份有限公司
前言：胺类药物(sulfonamides, SAs) 指具有对氨基苯磺酰胺结构的药物，主要包括磺胺嘧啶(sulfadi-azine)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfadiazine)、磺胺二甲基嘧啶(sulfadimidine)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)、磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline),在养殖业中广泛用于预防和治疗细菌感染性疾病。
动物组织、血液、蛋、奶、蜂蜜中磺胺类药物的检测方法已见诸报道, 主要有薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法或高效液相色谱柱前或柱后衍生荧光检测法。而在饲料的报道也有，多采用国标的方法。本文建立了SPE-HPLC-UV 测定饲料中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉5种磺胺类药物的方法, 结果令人满意。
1、实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：四元低压LabTech-HPLC；色谱柱：LabTechC18 4.6 mm×25 cm；LabTech旋转蒸发仪；Win-12手动固相萃取仪。
试剂：冰乙酸，优先级；甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；所用水均为超纯水。
流动相：在1 000 mL容量瓶中加入750 mL去离子水，移取冰乙酸3 mL加入水中，与250 mL乙腈混合，摇匀，过0.45 μm滤膜，脱气，备用。
磺胺类药物标准溶液浓度20 μ/mL：磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉。
固相萃取柱：碱性氧化铝SPE，500mg/3 mL。
1.2 样品处理
1.2.1 样品制备
饲料，打碎。
1.2.2 样品提取
称取混合饲料样品2 g，置于具塞锥形瓶中，加入 50 mL的乙腈于振荡器振荡提取 30 min，过滤，滤液备用。
1.2.3 样品SPE净化
准确吸取试液混合饲料2 mL，移入用10 mL乙腈淋洗过的碱性氧化铝小柱中，令其自然流速流出。待试液全部流出后吹干，用2次2 mL流动相洗脱，收集洗脱液，并过0.45 μm 的滤膜，滤液上HPLC测定。
1.3 HPLC色谱条件
流动相：乙腈:水(25:75）；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长为270 nm；进样量：20 μL；柱温：40℃。
2 结果与讨论
2.1 磺胺类药物的HPLC色谱图
将5种磺胺类药物混标进HPLC分析，磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉浓度均是4mg/mL。结果如图所示：见图1。
1.磺胺嘧啶；2.磺胺间甲氧嘧啶；3.磺胺二甲基嘧啶；4磺胺甲恶唑；5.磺胺喹恶啉
图1 5种磺胺类药物的HPLC色谱图
2.2重复性实验
将5种磺胺类药物混标进HPLC分析，磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉浓度均是2mg/mL，重复进样，重叠色谱图如下图所示，并且计算出峰时间重复性RSD均小于5%，见表1。
1.磺胺嘧啶；2.磺胺间甲氧嘧啶；3.磺胺二甲基嘧啶；4磺胺甲恶唑；5.磺胺喹恶啉
图2 5种标品的重叠色谱图
表1 5种标品的重复性及RSD%
标品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD（%） |
磺胺嘧啶 | 4.558 | 4.557 | 4.540 | 4.553 | 4.553 | 0.158 |
磺胺间甲氧嘧啶 | 6.377 | 6.373 | 6.360 | 6.377 | 6.377 | 0.116 |
磺胺二甲基嘧啶 | 7.597 | 7.590 | 7.573 | 7.587 | 7.582 | 0.118 |
磺胺甲恶唑 | 10.453 | 10.440 | 10.408 | 10.433 | 10.420 | 0.167 |
磺胺喹恶啉 | 16.950 | 16.935 | 16.895 | 16.917 | 16.893 | 0.147 |
2.3 饲料样品的空白色谱图和加标色谱图
饲料空白样品和加标样品经过提取，并通过小柱净化后，得到的色谱图见图3和图4.。
图3饲料样品空白的色谱图
1.磺胺嘧啶；2.磺胺间甲氧嘧啶；3.磺胺二甲基嘧啶；4磺胺甲恶唑；5.磺胺喹恶啉
图4饲料样品加标的色谱图（1 mg/kg）
2.2 饲料样品过SPE净化的回收率及RSD
采用加标样品（加标浓度磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶;磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉均为1 mg/mL），经提取、SPE净化处理，并用 HPLC分析，计算加标回收率及相对标准偏差，5 种磺胺类药物的回收率均在 82.65%~105.70%之间，RSD 均小于10%（表2）。
表2饲料样品中加标过SPE5 种磺胺类药物的回收率及RSD(n = 5)
峰序 | 保留时间（min） | SPE-1 | SPE-2 | SPE-3 | SPE-4 | SPE-5 | 平均值 | RSD% |
磺胺嘧啶 | 4.558 | 102.04 | 94.62 | 91.92 | 85.79 | 94.77 | 93.83 | 6.24 |
磺胺间甲氧嘧啶 | 6.377 | 108.14 | 99.90 | 98.39 | 91.99 | 100.78 | 99.84 | 5.79 |
磺胺二甲基嘧啶 | 7.597 | 108.46 | 102.18 | 106.25 | 107.78 | 103.85 | 105.70 | 2.51 |
磺胺甲恶唑 | 10.453 | 94.46 | 83.06 | 86.91 | 76.719 | 78.97 | 84.02 | 8.35 |
磺胺喹恶啉 | 16.950 | 93.22 | 85.57 | 80.65 | 76.54 | 77.28 | 82.65 | 8.35 |
3、结论
本方法对饲料样品提取，并采用SPE净化，并采用HPLC检测其中的5种磺胺类药物，5种磺胺类药物的回收率均在82.65%~105.70%之间，RSD均小于10%。实验过程操作简单，结果显示数据理想，可用于常规的饲料中磺胺类药物的检测。
参考文献
〔1〕GB/T19542-2007. 饲料中磺胺类药物的测定高效液相法.
〔2〕李兰, 索德成, 王培龙等.固相萃取 - 高效液相色谱法测定饲料中5 种磺胺类药物的研究,动物生产, 2008,44( 5) : 58- 60.
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