高效液相色谱法测定食品包装材料聚苯乙烯中的9种荧光增白剂
荧光增白剂（Fluorescentwhitening agents，FWA）是一种无色的荧光染料，在紫外光的照射下，可激发出蓝、紫光，与基础物质的黄光互补而具有增白的效果[1]，迄今为止，FWA已有的商品牌号约有2500个，全球产量将达40万吨[2]，应用的范围覆盖了纺织、造纸、洗涤剂及塑料等领域[3]，FWA在塑料包装材料中使用可以提高产品的白度和艳度，从而提高塑料包装材料的外观性能[4]。尽管有研究机构通过对人体健康和环境影响进行的风险评估，显示在目前的使用情况下风险较小[5]，但是由于荧光增白剂普遍含有芳香胺基结构和苯乙烯基结构，在毒理上具有潜在的致癌性，所以，很多国家的法律法规都对荧光增白剂有一定的监管和限制，我国国家标准GB9685-2008也对FWA393、FWA184和FWA236三种荧光增白剂的限用量和/或特定迁移量作出了规定，GB 9685-2008还规定了不同材质塑料制品中FWA的最大使用量[6]，美国则针对不同用途的塑料产品规定FWA184的加入量不得超过0.015%或者0.05%。因此，建立食品接触性塑料制品中荧光增白剂的定性定量检测方法，有利于对可能存在的违禁添加和超量使用荧光增白剂的行为进行监管。
目前，国内外关于荧光增白剂的检测方法主要有紫外灯直接照射观测法[7]、液相色谱法[8,10,11,14,15]和液相色谱串联三重四级杆质谱法[9,12]，其中紫外灯直接照射观测法只能定性检测，不能鉴定荧光增白剂的种类；液相色谱串联三重四极杆虽然可以对样品中的荧光增白剂准确定量定性，但液质联用仪的设备和检测成本高，限制了该方法的使用；液相色谱是现在化学实验室常配备的一种设备，价格相对较低，而荧光检测器具有较高的灵敏度。本研究根据荧光增白剂的光学性质，使用高效液相色谱-荧光检测器，建立了食品包装材料聚苯乙烯（PS）中的9种荧光增白剂（结构式见表1）含量的检测方法，方法操作简单、可靠，能够对样品中的荧光增白剂进行准确的定性及定量。
1.材料与方法
1.1材料与试剂
9种待测化合物标准品：FWA 52、FWA 184、FWA 199、FWA 367、FWA 368、FWA 378和FWA 393（梯希爱（上海）化成工业发展有限公司），FWA185和FWA135（Internatioanallaboratory U.S.A）以上9中标准品均购于安谱公司。
试验用品：甲醇（色谱纯）、三氯甲烷（分析纯）、超纯水。
1.2仪器与设备
WATERS高效液相色谱仪（2695）配荧光检测器（2475）；荧光分光光度计RF-5310PC（SHIMADZU公司）；MS3basic漩涡混合器（德国IKA公司）；KQ-250DV型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q去离子水发生器（美国Millipore公司）。
1.3方法
1.3.1标准溶液的制备
单标准储备溶液(1.0mg/mL)的配制：称取各标准品0.1000g于100mL容量瓶中，分别用三氯甲烷溶解并定容至刻度线，充分摇匀备用。此溶液于-18 ℃冰箱中可储存3个月。
混合标准储备液（50mg/L）的配制：各移取5.0mL单标准储备溶液于100mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度线，摇匀。
将混合标准储备液稀释到所需浓度标准工作液。
1.3.2试样处理
1.3.2.1制备：
用适当的工具将样品制成约0.5 cm×0.5 cm大小，混合均匀；在制备样品过程应注意防止交叉污染，每制备一种样品后都要对制备工具进行清洁。对于特殊的样品可参考GB/T5009.78-2003《食品包装用原纸卫生标准的分析方法》，若观测到样品中荧光物质分布不均匀，需鉴定所用荧光增白剂种类，可选取含有荧光物质的部位进行制备[7]。
1.3.2.2 样品前处理
准确称取2.5g样品于50mL具塞比色管中，加入30mL三氯甲烷超声提取至样品溶解，冷却至室温后用三氯甲烷定容，摇匀；移取10.0mL样品溶液于另一支50mL比色管中，于涡漩振荡器上边涡漩边缓慢滴加30mL甲醇，并用甲醇定容，摇匀静置后取1.0mL上清液过0.22μm滤膜，供高效液相色谱仪检测。
1.3.3液相色谱操作条件
色谱柱：CNW®Athena C18色谱柱(4.6mm × 250mm，5μm)；流动相：甲醇和水；梯度洗脱程序：甲醇：0~15min：75%~85%；15~35min：85%~95%；35~45min：95%~95%；流速：1.0mL/min；检测波长：发射波长λex：365nm；激发波长λem：430nm；进样量：10μL；柱温：35℃。
1.3.4测定步骤
将标准工作溶液按照质量浓度由低到高的顺序进样测定，在指定波长处，以色谱图中的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线。试样溶液进样后，以峰面积定量。
2.结果与分析
2.1检测波长的选择
使用荧光分光光度计对9种荧光增白剂溶液在220- 800nm范围内进行扫描，获取目标物的最大激发波长。使用荧光分光光度计，在已知的激发波长条件下，对9种荧光增白剂溶液在300-600nm范围内进行扫描，获取目标物的最大发射波长。9种荧光增白剂的最大激发波长和最大发射波长见表1。根据波长扫描结果发现9种荧光增白剂大部分的最大激发波长在365nm附近，而最大发射波长在430nm附近，故选择试验的波长条件为λex=365nm，λem=430nm。
表1. 9种荧光增白剂最大激发波长和最大发射波长
Table 1 The maximum excitationwavelength and emission wavelength of nine FWAs
2.2 溶剂的选择
试验对比了甲醇、甲苯、三氯甲烷、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二甲基乙酰胺（EMF）、四氢呋喃（THF）等溶剂对FWA的溶解性，结果显示三氯甲烷对9种目标FWA的溶解性最好，甲醇、甲苯和DMF等对于部分FWA的溶解率过低；而根据试验结果，三氯甲烷也对聚苯乙烯塑料样品很好的溶解，且作为溶剂，目标物的峰形较好，故选用三氯甲烷作为单标标准和样品的溶剂，然后再使用甲醇进一步稀释。而甲醇溶液也作为聚苯乙烯溶液的沉淀剂，但是实验过程应该在涡旋振荡器操作下缓慢滴加甲醇，以避免高分子聚合物沉淀过快而将待测物重新包裹成胶块，从而对检测结果造成影响。
2.3分离条件的优化
为选择适宜的流动相，分别用低、中、高不同比例甲醇/水、乙腈/水作流动相进行试验（图1）。结果显示，用甲醇水做流动相，9种目标物在CNW®Athena C18色谱柱中的保留较大，出峰时间相对较长，高比例有机相的流动相能加快目标物的分离速度；用乙腈代替甲醇不能提高荧光增白剂的分离效果，且增加了检测成本；在流动相流速恒定（1mL/min）的模式下，9种目标物分离效果不好；而将流动相甲醇/水的流速增加到1mL/min以上，虽然可以减少分离时间，但降低了分离度，部分目标物的色谱峰无法分开，同时还增加了柱压，会降低色谱柱使用寿命。通过对比，发现使用梯度洗脱程序，用甲醇和水做流动相，甲醇比例在15分钟内由75%到85%，到35分钟后升至95%，流速为1.0mL/min的条件下，9种目标物均能在40分钟内出峰，而且分离效果好。因此，选此条件进行分离。将9种不同浓度的荧光增白剂的混合标准溶液分别进入高效液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到标准色谱图（图 2）。在该条件下，9种荧光增白剂都能较好的分离；在相同条件下，重复该实验，方法重复性好。
图1. 不同流动相的分离效果（1.0mL/min；1. FWA 52, 2. FWA 199, 3. FWA 135, 4.FWA 185, 5. FWA 367, 6. FWA 393, 7. FWA 368, 8. FWA 378）
A:甲醇：水（30:70）；B：甲醇：水（60:40）；C：甲醇：水（90:10）；D：乙腈：水（90:10）
Fig. 2 The separation effect of different mobilephases
图2. 9种荧光增白剂标准色谱图
Fig. 2 The chromatogramsof standards of nine FWAs
（1.FWA 52, 2. FWA 199, 3. FWA 135, 4. FWA 185, 5. FWA 367, 6. FWA 393, 7. FWA 368,8. FWA 378, 9. FWA 184）
2.4 线性关系、检出限和定量限
在0.32～200 μg /L浓度范围内，标准曲线的相关系数均大于0.999 2（见表2），表明线性关系良好。以3倍信噪比( S/N = 3)计算，9种目标物的仪器检测限（ILOQ）为0.01 μg /L～0.08 μg /L；结合前处理条件的稀释倍数（100倍），确定方法定量限（MLOQ）为1.0μg /kg～8.0 μg /kg之间（见表2），表明方法具有较高的灵敏度。
表2 9种准曲线的相关系数、仪器检出限和方法定量限
Table 2 Thecorrelation coefficient for Matrix-Matched Calibration Standards and SolventCalibration Standards, the instrument detection limit and the method limit ofquantification
2.5 方法回收率和精密度
取具有代表性的阴性样品，进行了3个水平添加回收率实验，每个加标水平测定6次，方法回收率和相对标准偏差（RSD）见表3。回收率在88.0 - 98.9%之间，相对标准偏差在2.11 - 4.34%之间，说明方法的准确度和精密度达到分析要求。
表3 9种目标物的方法回收率和精密度（n=6）
Table 3 Themethod recovery and precision for nine compounds (n=6)
2.6 实际样品的检测
使用本方法测定了10种聚苯乙烯塑料样品。其中有1种样品检出含有FWA184（见图2），含量为920 μg /kg，未超过标准限量要求（0.02%）；其余样品均未检出所测9种目标化合物。
图2 阳性样品色谱图
Fig. 2 The chromatogramsof sample
3.结论
荧光增白剂所造成的环境的问题日益突出，但一直未得到足够的重视，至今为止，我国尚未颁布有关荧光增白剂定量的规范和标准。本文通过优化试验条件，建立高效液相色谱法测定食品包装材料聚苯乙烯中荧光增白剂的定量方法，同时测定9种荧光增白剂。本实验所建立的方法在CNW®Athena C18色谱柱的条件下具有灵敏度高、分离效果好、定量准确等优点，便于在检测机构中推广应用，对行业的监管能起到积极的作用，也可以此为据建立相关的规范或标准，为防范其造成更大的社会影响和环境危害做准备。
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