高效液相色谱法测定测定血清中替卡西林水平

dalong1234

2014/10/30

私聊

液相色谱（LC）

高效液相色谱法测定测定血清中替卡西林水平

卡替西林是一种半合成的抗假单胞菌青霉素，对于严重革兰阴性菌感染特别有效，除了用于治疗单胞菌感染，替卡西林也用于经验用于免疫受损的宿主。通常，这两种情况下，卡替西林总是与氨基糖苷类或头孢菌素联合应用。与青霉素联用的毒性一般是最小的，但当血清中水平高时，也会出现中枢神经系统的副作用。虽然不是常规要求，但是对于肾功能不全患者，特别与其他的β-内酰胺类抗生素联合用药时血清水平监测是很有必要的。

传统替卡西林的测定是通过微生物分析方法测定，该方法虽然划算，但这些方法总是缺乏与生化测定或免疫测定联用的特异性和精确度，而且需要最少8小时的孵育过程，不利于剂量调整。高效液相色谱法定量测定血清中替卡西林水平以及药剂中青霉素和头孢菌素和血清及尿液中替卡西林的测定在文献中均有报道，但均对于临床应用不宜，本实验做了调整优化，对于临床应用实用性较强。

材料和方法：

替卡西林/替莫西林均购自药店，甲醇，氯仿，冰乙酸，盐酸，正戊醇，醋酸铵，磷酸二氢钠为分析纯或色谱纯。

流动相为85（醋酸铵液）：15（甲醇）

醋酸铵液：醋酸铵液浓度为0.1M，并以冰醋酸调节PH为4

样品提取溶液预先配置室温保存：包含0.4N的盐酸，氯仿：正戊醇（3：1），0.1M磷酸盐缓冲液（PH=7），磷酸盐缓冲液用前按1：10用水稀释，去离子水。

标准，对照的配置：替卡西林二钠用灭菌的去离子水溶解后加入加热灭活的人血清中，配置浓度为50，100，200，400ug/ml,，并以同样方法配置250ug/ml作为对照。标准和对照血清分别以0.5ml分装，-70度保存。替莫西林以去离子水溶解于灭菌去离子水制成150ug/ml.，同法保存。标准和对照血清以及内标替莫西林用前融化。

样品制备：血清样品，标准和对照血清分别为0.35ml,加入0.15ml内标溶液，0.25ml 0.4N的盐酸，3.5ml的氯仿-正戊醇于带有螺旋盖的试管中。混合均匀后离心10分钟。上层弃去留下层。下层再加入0.35ml的磷酸盐缓冲液，混合均匀后离心10分钟。移取上层，4度保存备用。

液相条件：沃特斯2487配DAD检测器 water bondapak C18柱（10um×4.6mm×150mm），检测波长242nm.

进样量20ml, 流速1.5ml/min

定量：标准曲线通过替卡西林的峰高与内标峰高的比率以及内标峰浓度进行绘制。

提取效率：替卡西林和内标的回收率通过比较血清提取以及相同浓素的含水制剂的峰高

精密度：日内通过向正常血清中加入替卡西林，(75ug/ml，150 ,ug/ml，300ug/ml),进行测定，日间通过三周内10次测定获得。

样品获得：该试验中应用的血清样本来自临床上那些替卡西林水平需要监测的患者。

结果：1、血清中内标和替卡西林的提取后分析图谱如下：（内标和替卡西林的保留时间分别为5.4min,6.8min。

2、绝对回收率替卡西林血清回收率在29-385ug/ml范围内平均值为71%，而内标的回收率为67%，相对回收率，替卡西林在75-300ug/ml范围内平均为97%，如下图：

3、下图为替卡西林标准曲线

讨论：

1、本实验开发了一种运用高效液相测定血液中替卡西林水平的方法，将血清加入替卡西林作为内表。采用氯仿-正戊醇进行萃取，后反萃取于磷酸盐缓冲液中。以反向C18柱，乙酸铵-甲醇水为流动相，240nm下进行检测。虽然头孢西丁，头孢噻吩，头孢呋辛等与替卡西林保留行为相似，但抗生素联合使用对于替卡西林的检测没有影响。试验表明本方法对于单用及联用抗生素时对于卡替西林的快速检测是准确，可重现的

2、本试验所采用的高效液相法分析血清中替卡西林的方法准确、重现性好，当患者联合用药时也能快速检测不干扰。

3、本试验采用内标的方法，从而克服了样品到样品间提取的变数，因为结构相似我们采用替莫西林作为内标。在提取过程和色谱行为方面也证明了采用替莫西林的可靠性。

4.该方法可用于抗生素联合用药时患者血清中替卡西林的水平测定，在患者的服用剂量调整范围内也是可适用的。

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