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反相色谱流动相中离子对试剂的作用及使用注意事项

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2024/11/01

液相色谱（LC）

“ 对于一些大极性的可电离的化合物，我们把离子对试剂（ion-pair reagents, IPRs）加入到反相色谱流动相中来增强离子样品的保留，这种改良的反相色谱方法就被称为离子对色谱（ion-pair chromatography, IPC）。反相色谱中加入离子对试剂的主要作用是增强对离子性或极性化合物的保留能力，改善分离效果，并可能提高检测的灵敏度。”

离子对反相色谱法是在反相柱上通过向流动相中加入离子对试剂来进行的。例如，三氟乙酸用于与带正电荷的肽配对，而三烷基胺用于与阴离子如羧酸盐或寡核苷酸进行离子配对。

一、其作用机理有两种假设模型：

1. 离子配对模型，也被称为分配模型，其中分析物离子和离子对试剂离子之间的相互作用被认为是在流动相中发生的。分析物离子与反离子一起形成一个非极性基团，可以吸附在疏水性固定相上。随后，通过增加流动相中的有机相比例，离子对复合物被洗脱下来。

2. 离子交换模型，也称为吸附模型，离子对试剂，如辛烷磺酸钠，通过其疏水部分（如辛烷基）与色谱柱的固定相相互作用，而其带电部分（如磺酸根）则位于流动相中。这种设计使得固定相表面带上电荷，从而能够吸引并保留带相反电荷的分析物，尤其是那些在常规反相色谱中保留不足的离子性或极性分子。

二、具体来说，离子对试剂有以下作用：

1. 增强保留能力：不管基于以上哪种假设的保留机理，都是增强了极性离子样品在反相色谱上的保留强度。

2. 改善峰型：反相色谱柱的硅胶基质表面的羟基可能会导致目标化合物的峰形拖尾。离子对试剂能有效屏蔽这些羟基，减少样品与固定相的非特异性相互作用，从而改善峰的对称性和分离度。

3. 调节保留行为：通过调整离子对试剂的浓度和流动相的pH值，可以控制样品的保留时间。在较低浓度时，保留主要依赖于反相作用；随着浓度增加，离子交换作用增强，导致保留时间增加。

4. 选择性分离：不同的离子对试剂适用于不同电荷的化合物，例如四丁基氢氧化铵用于酸性化合物，而辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐则适用于碱性化合物。这种选择性有助于在复杂混合物中分离特定的目标化合物。

5. 动态离子交换：离子对的形成是一个动态平衡过程，既包括分析物与流动相中离子对试剂的结合，也包括离子对试剂与固定相的相互作用，这种动态性增加了分离的灵活性和复杂性。

三、使用注意事项
- 色谱柱的平衡时间会增加，需要更长时间来达到稳定状态；
- 过量的离子对试剂可能引入额外的复杂性，影响方法的重现性和柱子的寿命；
- 离子对试剂会使色谱填料发生改性，所以尽量专柱专用；
- 离子对试剂多为不挥发的盐，而且很难冲洗干净。

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