实时荧光定量PCR经验总结

张贝呗

2015/07/12

私聊

PCR

实时荧光定量PCR(real-time PCR)作为普通PCR的一项改进，随着分子技术的发展，在基因表达谱分析，基因定量分析，基因检测，SNP分析等多方面受到广泛应用。它的原理是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有灵敏度高，特异性强的特点。由于real-time PCR的这些特点，因此在操作中要特别的细致，每一个细节都可能影响到最终结果。
荧光定量PCR有多种方法，包括Taqman探针法，分子信标法，SYBR Green法，LUX Primers法等，我在的实验室一般采用SYBR Green法，而我也做过几次real-time PCR，结果从最初的一塌糊涂到现在的基本能用，期间走过不少弯路，也碰到过不少问题，现在想把这些问题写下来，希望给大家做一下借鉴吧。
1 实验前的准备
准备工作也很重要，开始前计算好要配的体系，样品布局，选择一个光线较暗，比较安静的环境进行实验。
2 实验中
每一个混合体系都要充分混匀，这一步非常重要，我之前因为没混匀，每次重复间误差非常大，结果都不能用，白白浪费了很大的功夫，现在我都用振动仪混匀，效果好了很多。另外，在将混合物分到PCR板的时候，枪头要吸打干净，不能有气泡，确保每个重复间的一致性。实验中要集中注意力，注意速度，因为时间一长，荧光效果可能会受到影响。
3 实验后分析
实验后及时整理分析数据，从扩增曲线，Ct值等方面总结实验经验和教训，为下一次实验开展积累经验。