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固相萃取柱在不同乳制品中检测三聚氰胺的应用

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2015/10/27

固相萃取柱在不同乳制品中检测三聚氰胺的应用

在检测奶制品中三聚氰胺前处理过程中，使用的强阳离子交换固相萃取柱的质量会影响三聚氰胺的准确性测定。不同厂家的强阳离子交换固相萃取柱，同一厂家不同批次的强阳离子固相萃取柱及同一家同一批次，在不同的操作者及操作条件都可以对三聚氰胺的准确检测产生影响。不同类型的奶制品中所含的杂质成分不尽相同，因此对三聚氰胺准确性检测的影响程度不一样。
由于本实验室没有质谱检测器，因此只能选择不同厂家的阳离子固相萃取柱研究前处理过程，三聚氰胺检测的不稳定性；选择不同的奶制品研究杂质成分对三聚氰胺准确检测的影响。

1 原理
试样中三聚氰胺经水和乙腈提取后，用液相色谱测定，外表峰面积法定量。
2 试剂
方法中所用试剂，除另有所规定外，均为色谱纯，水为超纯水。
2.1 乙腈：色谱纯
2.2 柠檬酸：分析纯
2.3 辛烷磺酸钠：色谱纯
2.4 50%甲醇水：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用
2.5 三聚氰胺标品：
2.6 三聚氰胺标志着储备液：精确称取三聚氰胺（Melamlne C14861400 ）0.1005g，用50%甲醇水溶液溶解定容至100mL的容量瓶中，混匀，得1mg/ml三聚氰胺标准储备液，于4℃保存，保存期为3个月。
2.7 微孔滤膜：0.45µm，有机相水相
3 仪器设备
3.1高效液相色HPLC（岛津）：配有紫外检测器或二极管阵列检测器
3.2分析天平（感量为0.0001g）：METTCER TVLEDV AB204-N
3.3高速离心机(转速不低于4000r/min)：上海安亭科学仪器厂
3.4超声波水浴：SCIENCE AS5150
3.5涡旋混合器：上海青浦沪西仪器厂 XW-80A
3.6水浴氮吹仪：HGC-12A
3.7无油隔膜真空抽滤泵：天津市津腾实验有限公司 CM-033A
3.8PH计：METTCER TOLEDO 1231265113
3.9固相萃取装置：CMW
3.10优普纯水仪器
4 试剂配制
4.1标准曲线：用不含盐的超纯水将（2.6）三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度为10，8，4,2,1,0.1µg/ml的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积，浓度作图，得到标准曲线回归方程。
4.2缓冲液：2.1000g柠檬酸钠+2.1600g辛烷磺酸钠于1000ml容量瓶，加入约980ml超纯水溶解，充分溶解后定容至1000ml
4.3 95%氨化甲醇：准确量取5ml氨水于100ml容量瓶，加甲醇定容至100ml
4.4 20甲醇水：准确量取20ml甲醇于100ml容量瓶，加超纯水定容至100ml
5 实验方法
5.1HPLC色谱条件：
分析柱：C8 4.6mm×250mm,5.0µm
流动相：准确称取2.1000柠檬酸和2,1600g辛烷磺酸钠，加超纯水溶解定容至1L，调
节PH3.0 备用
流速：1.0mL/min
进样量：20µL
柱温：40℃
波长：240nm
检测器：紫外检测器，254nm波长
根据保留时间定性，外表分面积法定量。
5.2样品处理
准确称取2.0000-3.0000g(精确到0.0001g)试样（液态纯牛奶、酸奶、奶粉）于25mL比色管中，加入10mL三氯乙酸，振荡均匀，加5mL乙腈，再加三氯乙酸定容至25mL,振荡混合后超声提取20min，然后移到50ml离心杯中，4000r/min离心20min。
净化：用3mL甲醇、3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取5mL上待净化澄清液上柱，再用3mL水、3mL甲醇除杂，然后用6ml95%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，控制过柱速度在1ml/min。洗脱液于50℃下用纯度99.99%氮气吹干，残留物用1mL20%甲醇水溶液定容，涡旋振荡1-2min使其充分溶解，过
0.45
µ
m滤膜，待HPLC
分析。

6 结果与分析
标准曲线的r均≥0.999
6.1奶粉

6.2纯牛奶

6.3酸奶

Agela ClearnertR PCX柱子 CNW Poly-Sery MCX柱子

6.4不同奶制品对三聚氰胺检测的稳定性影响
经检测，浓度为4µg/mL的三聚氰胺标准溶液，在相同检测条件下，其峰面积为151502.0，由此可计算，使用强离子交换固相萃取柱前处理奶制品所检测三聚氰胺的回收率，即检测值。
表6-1 固相萃取柱对不同奶制品中三聚氰胺检测稳定性影响
奶制品 SPE柱峰面积平均值（n=6） RSD（%）（n=6）

纯牛奶 P 132261.0 2.61
M 84804.2 2.57
酸奶 P 143249.0 2.69
M 88473.6 2.51
奶粉 P 195246.0 1.72
M 92727.8 1.33
注：P为Agela ClearnertR PCX柱子，M为CNW Poly-Sery MCX柱子
表6-2固相萃取柱对不同奶制品中三聚氰胺检测的回收率
奶制品 SPE柱回收率（%）（n=6）
纯牛奶 P 106.76
M 98.58
酸牛奶 P 115.36
M 106.72
奶粉 P 117.60
M 106.02
注：P为Agela ClearnertR PCX柱子，M为CNW Poly-Sery MCX柱子
由表6.1可看出，同种固相萃取柱前处理不同的奶制品，三聚氰胺的检测值差异较大。造成这种现象的主要原因是不同奶制品样品中含有不同的物质成分。奶粉中所含的物质中对三聚氰胺检测值的影响最少，其检测结果就最为真实值。在检测过程中，占据了强阳离子交换固相萃取柱中的作用位点，导致三聚氰胺的检测值与真实值相差较远。两种固相萃取柱在前处理各种奶制品样品时，其检测值具有一样的变化规律，其检测值：奶粉>酸奶>原料奶；不同中的阳离子交换固相萃取柱前处理奶样品，其检测值：P>M。
由表6-2可看出，Agela ClearnertR PCX柱子回收率比CNW Poly-Sery MCX柱子回收率要高。
固相萃取柱前处理奶制品样品时，影响检测值与真实值的差异的原因可能有以下几点：
（1）奶制品中成分复杂，含有较多纯蛋白质，在酸性的条件下，蛋白质也带正电荷，其可能占据离子交换固相萃取柱的作用位点，导致三聚氰胺没有完全保留在强离子交换固相萃取柱中，影响检测值。
（2）固相萃取柱对三聚氰胺的保留原理都是通过与磺酸基的相互作用而保留，若固相萃取柱的离子交换容量足够大，奶制品中的某些蛋白质或在酸性条件下带正电荷的其他物质与磺酸基进行相互作用，使固相萃取柱前处理的样品中的三聚氰胺含有其他成分，待HPLC检测时，可能会形成干扰峰，干扰峰可能与三聚氰胺峰分不开或重叠，影响检测结果，出现假阳性，从而出现含量偏高的现象。还由色谱图中看出，Agela ClearnertR PCX柱子前处理样品的色谱图干扰峰多点。
（3）理论上回收率越高越好，但根据添加三聚氰胺标准品的含量要求回收率为80-110%。CNW Poly-Sery MCX柱子前处理奶制品的回收率更符合我司对三聚氰胺回收率的要求，并且由表6-1中RSD的值可知，CNW Poly-Sery MCX柱子前处理奶制品中三聚氰胺的稳定性比Agela ClearnertR PCX柱子要好。
（4）Agela ClearnertR PCX柱子前处理样品，由色谱柱图片中可看出，出现较多的杂峰由检测结果可得，CNW Poly-Sery MCX柱子更符合我司对三聚氰胺检测要求，所以我们一直保持沿用CNW Poly-Sery MCX。

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dahua1981

第1楼2015/10/28

应助达人

原创活动上个月就结束了

0

WUYUWUQIU

第2楼2015/10/28

应助达人

版面的原创活动继续

0

999youran

第3楼2015/10/28

换是可以换背包的和茶具的

0

symmacros

第4楼2015/10/29

应助达人

两个色谱图太小了，能不能放大看看呢？

0

滴定者

第5楼2015/10/29

感谢对我们的支持，欢迎常来论坛逛逛

0

dahua1981

第6楼2015/10/30

应助达人

背包比茶具好点
999youran(999youran) 发表:换是可以换背包的和茶具的

0

999youran

第7楼2015/10/30

只有收到茶具后才知道，茶具确实没背包好
dahua1981(dahua1981) 发表: 背包比茶具好点

0

乐知者

第8楼2015/10/30

分析的很专业很到位，赞一个，体现出安谱在spe小柱上对原料以及稳定性和平行性的把控，赞

0

千层峰

第9楼2015/10/30

旧版茶具特别点。。
dahua1981(dahua1981)发表: 背包比茶具好点

0

WUYUWUQIU

第10楼2015/10/31

应助达人

这个是标准的操作过程吗

0

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