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凝胶色谱中的几个基本概念

lu_sunshine

2016/07/23

私聊

凝胶色谱（GPC）

凝胶色谱中的几个基本概念
前言：
作者在日常工作中经常遇到一些GPC/SEC操作者，因对一些基本概念认识不够，不得不一再解释说明基本概念的情况。本着学习和普及一些基础小知识的目的，写了一篇小文可以作为查询。因本文概念较多，不免枯燥之处，但还是希望以跟大家谈话的方式来书写。尽量图文并举。文中的图片和概念多引用于施良和的《凝胶色谱》一书和目前主要厂商的公开文献。一并表示感谢，若有不妥之处请及时联系作者。当然，鉴于作者水平有限，不当之处请大家多多指正！期待和您的交流。
一、GPC/SEC名称的来源
凝胶色谱工作者在日常工作中会发现关于很多凝胶色谱的简称或者简写，例如:GPC/SEC等。为什么会出现这样的描述呢?这些需要从它的发展历史来看，可以得到一些启示：
凝胶色谱是在1950年代才发展起来的一种新型液体色谱,是色谱中最新的分离技术之一.它的分离基础主要根据极稀溶液中分子体积(流体力学体积)的大小。形象的来看,犹如对溶液中所有的组分按分子体积大学进行过筛,在很多情况下有独特的分离效果,因而在化学的许多领域中得到了广泛的应用。

1953年Wheaton和Bauman利用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其他非离子物质；1959年Porath和Flodin用交联的缩聚葡萄糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的试样,并冠以’Sephadex’商品出售。在生物化学领域中广泛应用,命名为凝胶过滤。1964年-1965年Moore和Maly分别试制成功以苯乙烯和二乙烯为主的不同孔径的凝胶,和利用DRI来分析以体积为指示器的表征分子量的凝胶色谱仪,并立即商品化.凝胶色谱在高分子科学领域被广泛应用起来。

由于历史原因,凝胶色谱的理论发展、实验技术和应用开发主要在生物化学和高分子领域内,故不同工作者采用了不同的命名.文献中出现过的,名字主要有:凝胶过滤(gel filtration),分子筛过滤(molecular sievefiltration),分子筛色谱(molecular sieve chromatography),排除色谱(exclusion chromatography),凝胶渗透色谱(gelpermeation chromatography)，体积排除色谱(size exclusion chromatography)……一般我们使用GPC/SEC，且较为常见。
二、表征分子量及分布
高分子是由数目庞大的小分子聚合得到的高分子量的化合物。单体一般是气体、液体，即使是固体，其机械强度和韧性很低，然而，当它们聚合成高聚物后，其机械强度可以和木材、水泥甚至钢铁相比，弹性、韧性接近棉、毛。正是因为它的极高的分子量使其物理性能同小分子有质的差别。聚合物材料的性能在一定范围内随分子量的提高而提高，例如，抗张强度、冲击强度、弹性模量、硬度、抗应力开裂、粘合强度随之提高。为此我们期望聚合物材料有较高的分子量。另一方面，太高的分子量又给材料加工造成困难。兼顾到材料的使用性能与加工性能两方面的要求，高分子的分子量大小应控制在一定范围之内。平均相对分子量和分子量分布是高分子材料最基本，也是最重要的结构参数。对低分子物质而言，分子量是一个确定的值。但聚合物不是这样。由于聚合过程复杂，即使同一种聚合物，分子链也长短不一，分子量大小不同。聚合物分子量的这种特征称为“多分散性”。且不同分子量组分的比例分布也非常重要。平均分子量相同的聚合物，可能由于其中分子量分布不同而性质各异。

1、平均分子量的定义：

假设一个高聚物总共有 n个分子质量为w

常用的统计平均分子量有以下几种：
（1）数均分子量：以数量为统计权重的平均分子量：

（2）重均分子量：以重量为统计权重的平均分子量：

（3）z均分子量：以z值为统计权重的平均分子量：

（4）粘均分子量：用稀溶液粘度法测得的平均分子量：

2、分子量分布的表示方法：
⑴分子量分布曲线

图中可以看出，Mn⑵多分散系数d
聚合物分子量分布可用多分散系数d来表示：

在这里需要指出的是，表征分子量分布的方法还有很多，例如枝化数，枝化比率，Rg 与 Rh等等……在这里我们只讨论最基本的概念，如果有必要后续会对涉及到的概念一一解释。同时，当我们拿到报告中含有分子量数据时，请您一定要确认他是用什么方法测试，他的表征是重均分子量还是其他慨念的表征，以防在数据上发生误会，出现数据不一致的情况！详细内容我们可以根据下面的图进行对比，从根本上区别开来。
3、其他表征分子量的方法：

三、GPC/SEC方法的不同和检测器测试手段发展的关系
1、ConventionalCalibration传统校正法---浓度型检测器DRI or UV-Vis

GPC/SEC其实是液相色谱的一个发展和分枝。最初人们发现这个分离方式时，只有浓度型检测器来检测信号数值，通用是视差折光检测器（Refractive Index）后续因为HPLC常用UV-VIS，也可以做有特征吸收峰的物质。通常是做法是先做7-12窄分布的标准样品，一帮来说是PS,PMMA,PEG/PEO,拟合成logMw对保留体积Rv一条曲线来校正色谱柱，在一定范围内，测试未知物的分子量，即物质的相对分子量。这种测试方法对未知物的浓度没有要求，因为在计算是把数值的dn/dc值上下约去。（关于dn/dc值，是物质的折光指数增量只与其单体和溶液体系、温度等相关，与是否枝化，分子量大小无关。可以理解成物质特性）所以可以把3-5中标准样品混合到一块，减少作样的次数。节约时间。

2、UniversalCalibration 普适校正法---浓度型检测DRI or PDA +Viscometer

普适校正基于传统校正并进行了改进，不仅考虑到了物质的分子体积还考虑到了分子粘度或者说分子密度。大大提高了对某些物质的测试准确性，所以一般把测试结果称为绝对分子量。并且可以表征分散体系的特征，例如枝化，特征粘度_branch < _lin 等。不过，它的缺点也是显而易见，就是还需要对色谱柱用7-12标准品进行校正。

3、光散射检测器及多检测器联用---光散射+浓度型检测器DRIor PDA + Viscometer（可选）
科学技术日新月异，基于光散射技术的成熟，GPC/SEC检测中添加了光散射。此方法操作简单，仅需要做两个标准样品，即窄分布标样计算仪器常数，宽分布标样验证方法的可靠性。就可以测试未知物，便提供绝对分子量（absolutemolecular weight ）及分布，Rg ，Rh ，IV ，构象(conformation) ，缔合（aggregation) 和支化度(branching) 信息。大大节约时间，更加准确表征了。特别需要提出的是在《Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography》中提到了小角光散射可靠性和准确性。

4、其他MALS,与其他仪器DLS，MS，等的联用……

本部分简约的说明了，校正方法的发展和优缺点。每个部分还有很多注意细节，若需讨论，我们可以再另辟一个主题……

四、色谱柱的选择和联用

GPC/SEC的核心选择就是在基于文献以及经验上，来选择色谱柱。色谱柱是分离的核心部分，商用的色谱柱专业性较高，需要我们精心选择。在分类上可以根据流动相的选择来分为水相和有机相；可以根据胶体的孔径及分布与被测试试样分子体积范围的匹配来分，一般在5-10um之间。我们可以根据厂家提供的说明书，来使用色谱柱，并要注意合理的贮存办法。
还有一点需要注意，就是在选择和搭配不同排阻体积色谱柱时，注意要使试样中各组分有较好的分离，分离度R应尽量高。一般应注意提高理论塔板数来选择柱校高的色谱柱，不推荐增加色谱柱的数量。但还要注意色谱柱的合理搭配。

附件：

凝胶色谱的几点基本概念.pdf

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