超微结构保存更好——高压冷冻与冷冻替代样品制备技术

qflaabbcc

2016/09/23

私聊

透射电镜（TEM）

最近一直在摸索着用高压冷冻和冷冻替代样品制备技术，刚开始做的时候冰晶特别严重，如下图Hela细胞。冰晶已经把细胞超微结构破坏的不行了。

经过很长时间的摸索，得到以下制样方法：
1 取样
1.1 培养细胞：取适量的细胞悬浮液，低速离心成细胞团，去上清，细胞团呈米糊状，用移液枪取适量细胞，填满Carrier，加入适量冷冻保护液1-Hexadecene，滤纸吸取多余水分，使冷冻保护液液面略高于Carrier（Carrier用丙酮清洗，然后在空气中晾干，用1-Hexadecene浸泡备用）。
1.2 小鼠肝脏：从活体上取出的组织，先用锋利的刀片在低温下切成尽可能薄片状，从中挑选合适的部分切下来，然后装入Carrier，加入适量冷冻保护液1-Hexadecene，滤纸吸取多余水分，使冷冻保护液液面略高于Carrier。
2高压冷冻
高压冷冻仪在使用前，要先做一些准备工作：要先加入足够的液氮，并加入压力液甲基环己烷，然后用空载的carrier高压冷冻三次，保证高压冷冻仪在最佳工作状态。
2.1 将上述装有样品的carrier快速安置到高压冷冻仪，准备高压冷冻。
2.2 高压冷冻样品，迅速把样品冷冻下来，并做好记录。通过高压冷冻仪冷冻样品后产生的冷冻速度和压力变化曲线，可以选择冷冻效果较好的样品继续下面实验。
2.3 转移样品，首先把现配的替代液1%锇酸（0.5g锇酸溶于50mL丙酮）分装到2mL冻存管中，迅速放入液氮冷冻备用，冷冻过程中保持冷冻管直立。与此同时，冷冻替代仪加满液氮，将自制的冻存管架放入样品腔，预冷至-100℃。用预冷的镊子，在液氮下将Carrier分别装入冻存管，冻存管盖不宜拧的过紧，然后迅速转移到冷冻替代仪样品腔室的冻存管架里。
3 冷冻替代

步骤	温度	时间
1	-100℃ -90℃	4h
2	-90℃	72h
3	-90℃ -60℃	8h
4	-60℃	8h
5	-60℃ -30℃	4h
6	-30℃	8h
7	-30℃ -20℃	2h
8	-20℃	8h
9	-20℃ 4℃	2h
10	4℃	1h

温度达到4℃后，用4℃的丙酮浸洗样品3次，每次15分钟。此过程中，会有部分样品与Carrier分离，若还有没分离的可以用解剖针将样品从Carrier中剥离。
4 渗透包埋
分别用以下渗透液渗透。

步骤	渗透液	浓度	时间
1	Epon812/丙酮	1:1	1.5-2h
2	Epon812/丙酮	3:1	6-12h
3	Epon812	100%	1h
4	Epon812	100%	8h
5	Epon812	100%	1h

然后将样品转移至包埋槽，60℃烘箱聚合48h。
5 超薄切片
把两种生物样品对应的每一个包埋块分别超薄切片，各捞两个铜网，并染色。
6 电镜观察
观察细胞内超微结构保存情况，对感兴趣区域拍照。
终于有所改善，如下图的小鼠肝脏细胞，轮廓十分清楚，结构保存完好。

局部放大后观察，能看见核孔，双层核膜，甚至是膜的磷脂双分子层结构（这是在常规化学固定制样中很难看到的），看到这些让人激动不已。

碰巧看见一个正在分裂的线粒体。线粒体脊很清楚，双层膜紧挨着，不像常规制样间隙那么大。另外，线粒体基质保存完好，所以线粒体整体较细胞基质反差大。

以下是常规化学固定制样的结果，可与上面高压冷冻及冷冻替代制样技术结果对比：

与常规化学固定相比，高压冷冻及冷冻替代技术制样有以下优点：
1 分辨率更高。能看见细胞内各种细胞器膜的磷脂双分子层的结构，这个在常规制样中看不到。
2 结构保存更真实。线粒体的双层膜更紧凑，常规制样因抽提等影响导致双层膜间隙较大。
希望能与同行多交流高压冷冻仪和冷冻替代制样技术，大家共同进步。

分
该帖子已被版主-洪星二锅头加8积分，加2经验;加分理由:感谢分享

相关话题