仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >特色服务 > 厂商论坛 > 帖子详情

pH对分离选择性以及峰形对称性的影响

happytiankong1

2017/01/17

1概述
在使用HPLC进行分析方法开发的时候，影响分离选择性以及色谱峰对称性的因素有很多，即包括仪器硬件方面的因素，如色谱柱的选择，流动相的种类、添加剂的种类以及浓度、流动相pH的控制、色谱柱温度的控制等等，也包括仪器控制的软件部分，如检测器带宽的选择、采样频率的选择等等。

在HPLC方法开发的过程中，色谱柱以及流动相的选择起决定性作用，而对于流动相的pH的控制，不仅会对色谱柱的稳定性产生影响而且对于分离的选择性以及色谱峰的对称性也起到至关重要的作用(特别是对于可离子化的极性酸碱化合物来说)。
一般来讲，在典型的ODS色谱柱上，pH对于中性化合物的分离选择性以及色谱峰的对称性没有影响，这是因为中性分析物以及色谱柱的选择性配体ODS均不具有解离能力，因而不会影响到分析物的分离选择性；然而对于一些极性改性或者Mixed-Mode类型的色谱柱而言，虽然分析物不含有可解离部分，但是pH会影响到色谱柱上的选择性配体的状态，进而影响到中性化合物的分离选择性以及色谱峰的对称性。
如下图1所示，不同pH对于中性非极性化合物、极性不可解离化合物以及极性可解离化合物的分离选择性的影响。

2pH对选择性的影响
从pH的定义来说，其是溶液中质子的摩尔浓度的对数，取相反数，与质子浓度有关。pH越大，溶液中的质子浓度越小，pH越小，溶液中的质子浓度越大。对于水溶液，在25℃下，其解离常数为10-14。对于酸碱极性化合物，其在水溶液中发生解离，解离程度与水溶液的pH以及化合物本身的pKa有关，如下图2所示。

从上图2，可以看出当水溶液的pH偏离化合物本身pKa 2个单位以上时，化合物主要以一种形态存在，而当pH在化合物本身pKa 2个范围以内时，化合物以两种形态存在(不解离与解离形态)，而当溶液的pH等于化合物本身的pKa的时候，化合物解离形态与不解离形态大约各占50%，如下表1所示。

pH对于极性可解离化合物在ODS色谱柱上的分离选择性的影响，主要就是通过控制分析物的解离状态，改变其与固定相上的选择性配体的相互作用能力来实现的(不解离状态化合物的极性相比解离状态化合物要小的多，与固定相配体之间的相互作用要强得多)。
可解离极性化合物在ODS-HPLC上的容量因子与pH的关系，如下图3所示，以容量因子对pH作图，如下图4所示。

从上图4可以看出，极性可解离化合物的容量因子与pH之间呈现S型曲线。对于碱性化合物而言，pH越大，其容量因子也越大；对于酸性化合物而言，pH越小，其容量因子也越大，这也是在使用反相HPLC“酸加酸，碱加碱”的原因，其目的在于抑制酸碱极性化合物的离子化作用，增强与ODS固定相之间的相互作用，而提高该类化合物的保留时间。
值得注意的是，上述所说的是ODS类典型反相色谱柱，如果脱离这个特定条件的话，有可能会得出相反的结论，如正相色谱以及亲水相互作用色谱(HILIC)。
因此，对于酸碱极性化合物的分析方法开发的时候，可以通过调节流动相的pH来改变目标化合物的保留时间，从而达到提高相关组分分离度的目的，如下图5所示。

3pH对色谱峰对称性的影响
对于ODS类型的反相色谱柱来说，疏水相互作用是其主要作用机理，酸碱可解离极性化合物解离之后形成的离子形态，与固定相硅胶残留的硅醇基之间的二次极性相互作用，是色谱柱分析酸碱极性化合物，色谱峰拖尾，对称性差的根本原因。

如硅醇基的pKa大概为5左右，在pH为7的时候，基本可完全解离带负电，在分析带有正电的碱性化合物的时候，二者之间的强极性二次相互作用，导致其色谱峰发生严重拖尾现象。
当然，极性化合物发生严重的拖尾现象，有时并不是上述原因所导致。如目前所用的反相C18色谱柱，有很多均采取了封端处理，在分析极性化合物的时候，依然会产生严重的拖尾现象，其可能主要原因为，极性化合物解离之后形成的带电离子外围的水合层，影响了其与固定相配体之间的相互作用，从而导致超载现象，此时可以通过降低分析物的浓度，改善色谱峰的对称性。
无论上述哪种情形导致的色谱峰拖尾，色谱峰对称性差的情况，均可以通过改变流动相的pH，抑制分析物的解离来改善极性可解离化合物的色谱峰对称性，如下图6所示。

4有机相对于流动相pH以及极性可解离化合物pKa的影响
如上所述，pH的大小与溶液中的质子的浓度有关，是质子浓度大小的间接量度。如纯水在25℃下的解离常数为10-14，pH为7。当在水溶液中添加了有机相如甲醇的时候，由于甲醇的解离常数为10-16.6，将水与甲醇进行混合之后，其pH应在7-8.3的范围之内。

在配置流动相的时候，将水相调pH到某一值，在使用的过程中，随着有机相混合比例的不断变化，其pH是不断增加或者减小，有机相的比例增加越多，pH的变化也就越大。水相-有机相的pH变化程度与添加的酸碱的种类，有机相的种类及比例有关，对于乙腈而言，有如下关系，如下图7所示。

另有很多时候，我们会在水相以及有机相中同时添加同等浓度的酸碱，如TFA等，此时我们的目的并不是为了保证流动相在混合之后维持pH的一致性，事实上，由于有机相的加入，如乙腈或者甲醇等，尽管有机酸碱的浓度一致，也无法保证pH的一致性。其目的在于维持由于有机相的加入而造成的有机酸碱浓度的变化，进而对于基线的影响处于同一水平。
如下图8所示，乙腈的加入比例对pH的影响，对于有机酸添加剂如乙酸体系而言，当乙腈的比例从0.1到0.6的时候，pH变化了0.8个单位，随着乙腈的进一步增加，pH甚至会增加到2个单位以上；对于氨水碱性体系，随着有机相的加入，pH不断减小。

有机相的加入除了会影响到流动相的pH之外，也会使得分析物甚至添加剂的pKa发生变化，且使得缓冲液的缓冲能力降低(有机相比例越大，缓冲能力降低越多)，如下图9所示。

可解离极性酸碱类化合物的pKa随有机相的添加，其变化方向以及大小与极性化合物的种类，缓冲液的种类、pH以及有机相的添加比例有关，如下图10所示。

一般地，酸性化合物的pKa会随着有机相的添加比例的增加而变大，碱性化合物的pKa会随着有机相的添加比例的增加而减小。
如上所述，有机相添加不仅会使得流动相的pH发生改变，也会使得极性可解离化合物的pKa发生变化，因此在实际选择流动相以及调节pH的时候，最好把这部分因素也考虑进去，在色谱柱的耐受范围内，尽可能地调节pH远离化合物本身pKa(特别是对于含有多个碱基或者酸基的化合物)。
此外，改变极性可解离化合物的分离选择性以及色谱峰对称性，除了可通过改变流动相的pH之外，也可以通过其他手段实现，如使用其他类型的色谱柱或者使用缓冲盐溶液等。

5结论
pH的大小影响到极性可解离化合物以及色谱柱硅羟基的解离程度，离子化的分析物在典型的ODS反相色谱柱上往往会出现拖尾现象。通过改变流动相的pH，抑制其解离，可改变极性可解离化合物的容量因子，改变其出峰位置，提高分离的选择性，且提高色谱峰的对称性。此外，有机相的添加会使得流动相的pH以及待分析化合物的pKa发生改变，因此在调节流动相pH的时候，最好将此部分也考虑进去，在色谱柱的耐受范围内，尽可能地调节pH远离化合物本身pKa。

相关话题

happytiankong1

第1楼2017/01/17

分享的这篇文章把PH对分析的影响剖析得很深入

0

happytiankong1

第2楼2017/01/17

一般来讲，在典型的ODS色谱柱上，pH对于中性化合物的分离选择性以及色谱峰的对称性没有影响，这是因为中性分析物以及色谱柱的选择性配体ODS均不具有解离能力，因而不会影响到分析物的分离选择性；然而对于一些极性改性或者Mixed-Mode类型的色谱柱而言，虽然分析物不含有可解离部分，但是pH会影响到色谱柱上的选择性配体的状态，进而影响到中性化合物的分离选择性以及色谱峰的对称性。
***********
所以在分析时，首先要了解分析化合物的性质～

0

微雨燕双飞

第3楼2017/01/17

分析的很好，值得借鉴

0

吕梁山

第4楼2017/01/18

酸度对出峰时间影响最大吧

0

吕梁山

第5楼2017/01/18

我以前做电泳的时候酸度对分离效果也有影响

0

近期热榜

热门活动

猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐

品牌合作伙伴

日立科学仪器

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

日本电子株式会社

赛默飞世尔科技

马尔文帕纳科

上海仪电科仪

梅特勒托利多

布鲁克核磁

举报帖子

点赞用户

好友列表

加载中...

正在为您切换请稍后...