硫酸粘杆菌素方法开发纪要

段科

2017/07/03

私聊

液质联用（LCMS）

话说为了应对市场需求，需要进行硫酸粘杆菌素的检测方法的开发，查找标准方法，大致浏览下用液质进行检测，基本资源有满足，开始工作。

1.化合物性质及结构
先介绍下硫酸粘杆菌素，分子结构图如下：

分子式：2(C₅₂H₉₈N₁₆O₁₃).5(H₂SO₄)，分子量：2801.27，纯度80.1%，PH3-7.5范围内稳定，为硫酸粘杆菌素A和硫酸粘杆菌素B的混合物。
2. 配制标样。
用十万分之一的天平，称取硫酸粘杆菌素10.20mg至10mL容量瓶中，用换算成硫酸粘杆菌素浓度C=2=1347.98mg/L,用体积比V₁+V₂=1+4的0.1甲酸乙腈溶液溶解，并配置成10mg/L工作液。
3. 仪器方法建立。
3.1质谱条件
3.1.1寻找母离子
硫酸粘杆菌素是由氨基酸缩合而成的碱性多肽类抗生素，在一级质谱中易与多个H +结合成多电荷正离子,初步选定流动相A1+B2=3+7，接双通，流速0.2mL/min,进浓度为5.0mg/L的标准品1μL，初始Fragment为100,用MS2 SCAN正模式扫描，得到ESI正离子模式全扫描质谱图如图所示，硫酸粘杆菌素的三电荷离子^{3 +}响应最高，，进而确定它们的母离子(m /z) 分别为390. 5、385. 8。

3.1.2优化Fragment电压
将扫描模式该为MS2 SIM模式，将得到的Precursor Ion输入，驻留时间Dwell设为20，Fragment从1v-200V范围设置，在其他仪器条件不变的情况下进样，得到不同Fragment下的响应强度图，初步选定其Fragment在100V左右，进一步在100左右细化Fragment，最终选定硫酸粘杆菌素A和B的Fragment为110V。

3.1.3 ProductIon和CE优化
将扫描模式选为Product Ion模式，将390.5和385.8作为Precursor Ion，MS2 From 100，MS2 To 400（包含母离子），Fragment选定优化好的110V，碰撞能按照CE=左右寻找，得到子离子，选定包含国标的离子，并得到大致CE范围，将扫描模式选为MRM模式，在得到的初步CE左右，进一步优化得到最佳的CE值。

综上，得到硫酸粘杆菌素的质谱条件，如下表：
表 1 目标化合物的质谱分析条件

No.	中文名称	英文名称	CAS	前体	产物	去簇电压	碰撞能	加速电压
				离子	离子	(V)		(V)
1	硫酸粘杆菌素A	Ceftriaxone Sodium	1264-72-8	390.5	384.7*	110	5	4
					378.8	110	8	4
					100.9	110	20	4
2	硫酸粘杆菌素B	Ceftriaxone Sodium	1264-72-8	385.8	380.0*	110	5	4
					373.9	110	5	4
					100.9	110	20	4

注：* 为定量离子。
3.2 流动相条件

液相条件的寻找，首先确定流动相，在双通的用乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水=5+5、乙腈+0.1%甲酸水=3+7 3种比例条件下看峰型和响应的大小，选定乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最好，然后乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水5mmol/L乙酸铵=7+3、0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水=7+3，出峰强度和峰型与乙腈+0.1%甲酸水=7+3基本一样，确定硫酸粘杆菌素在流动相比例乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最佳，先接色谱柱，笔者试验Agilent EclipsePlus C18 RRHD 1.8μm2.1*100mm，Waters HSS T3 1.8μm，Agilent XDB-C18 1.8μm，最终发现Agilent XDB-C18 1.8μm，对目标化合物分离效果及峰型最好。

4.用建立好的仪器方法配置标曲
硫酸粘杆菌素 St50μg/L, 100μg/L,200μg/L,400μg/L,600μg/L.

4.前处理条件
4.1.化合物分析

粘杆菌素为多肽类抗生素，含有多个氨基，极性很强，易溶于水，微溶于甲醇等有机溶液，PH3-7.5范围内稳定，可用HLB和阳离子交换柱进行净化。
4.2试验方法
4.2.1 前期试验
通过国标方法及文献资料，选择4%三氯乙酸+4%乙酸铅， 10%三氯乙酸：乙腈=3:7溶液作为提取溶剂，提取离心后，用正己烷净化，过500mgHLB ，3mL水淋洗，3mL5%甲醇/水淋洗，6mL甲醇洗脱 35℃旋转蒸干或者N₂吹干上机分析，加标小瓶中理论值100μg/L，全程试剂空白，猪肉未知样品，及加标回收，均一样大，sp100μg/L有明显的基质干扰，单纯的标准品35℃旋转蒸干或者N₂吹干上机分析，无回收。
4.2.2前期试验分析与总结：
a.最终进样不能吹干或旋干，选择N₂（35℃以下）吹至1mL以下；
b.HLB洗脱接受后，溶液较浑浊，说明HLB净化效果不佳；
c.提取液4%三氯乙酸+4%乙酸铅较其他两种浑浊；
d.分析化合物有多个氨基可选择离子交换柱， WCX柱。

4.2.2 再次试验
称样5.0g
--- 添加标准品1mg/L×100μL
---加入10%三氯乙酸：乙腈=3:7 15mL
----充分混匀，超声20min，离心
----上清液倒入新离心管
---- 残渣继续用10%三氯乙酸：乙腈=3:7 10mL提取一遍
----合并上清液，用氨水调PH=7
---- 加入10mL乙腈饱和的正己烷，充分混匀，离心
----弃去正己烷层，下层过WCX（200mg,6cc），甲醇水平衡
----5mL水淋洗
----5mL甲醇淋洗
----6mL甲酸：甲醇=1:4洗脱，接收
----用N2在40℃下吹至1mL左右，用水定容至2mL，过0.22μm滤膜。

线性范围：25μg/L，50μg/L,100μg/L,150μg/L,200μg/L基质标曲。得到如下谱图：